In Vitro Ventriküler Destek Cihazları için Tromboz Testi

Ventriküler destek cihazlarındaki potansiyel trombojenik sıcak noktaları belirlemek için pratik ve erişilebilir bir tezgah üstü protokol geliştirmeyi ve erken prototipleme ile hayvan testleri arasındaki kritik boşluğu doldurmayı amaçlıyoruz. Hayvan testleri, ventriküler destek cihazlarında trombozu değerlendirmek için birincil yöntem olarak devam etmiştir. Hesaplamalı akışkanlar dinamiği, tasarım doğrulaması için paha biçilmez bir araç haline gelmiş olsa da, henüz in vitro ve in vivo doğrulamanın yerini alamaz.

Kan pıhtılaşma varlığının karmaşık doğası ve çok sayıda kafa karıştırıcı faktör, gerçek cihaz trombojenisitesi ile deneysel artefaktlar arasında ayrım yapmayı zorlaştırır. VAD'lerde trombozu değerlendirmek için in vitro yöntemler yeterince kullanılmamaktadır ve bugüne kadar standart bir yöntem mevcut değildir. Kapsamlı bir protokol ve video kılavuzu sunarak, tezgah üstü yöntemlerin daha geniş çapta benimsenmesini kolaylaştırmayı umuyoruz.

Bu yöntem, tıbbi cihaz geliştirmede hem teknik hem de etik bir zorluğu ele alarak, hayvan testlerine olan bağımlılığı azaltırken, geliştirme sürecinin erken aşamalarında tromboz risklerini tespit etme yeteneğini geliştirir. Başlamak için test döngüsünü 150 mililitre kanla doldurun. Döngüde sıkışan tüm havayı ortadan kaldırın.

Eksenel akışlı bir kan pompası kullanıyorsanız, kaldırma kuvveti yoluyla havayı serbest bırakmak için dikey konuma döndürün. Santrifüj pompa kullanıyorsanız, ikincil akış yollarında hava sıkışmadığından emin olmak için ters çevirin ve döndürün. Boru ve rezervuar yüzeylerine hafifçe vurun ve yerinden çıkarmak için hava kabarcıklarını sıkın.

Hava kabarcığı olmadığından emin olmak için borunun yatay bölümlerini ve boru ile konektörler arasındaki bağlantıları yakından inceleyin. Sıvı seviyesini dar üst kısma yaklaştırmak için intravenöz torbayı sıkın. Ardından, sıvı-hava arayüzünü ortadan kaldırmak için torbayı sıvı hattı boyunca bir kanama durdurucu ile sıkıştırın ve havalandırma vanasını kapatın.

Ardından, basınç hatlarının sonundaki vanayı kapatın. Manometre hortumunu çıkarın ve üç mililitrelik bir şırınga takın. Vanayı açın ve uzatma hattına yaklaşık dört santimetre olan bir ila iki mililitre sıvı çekin.

Vanayı kapatın, şırıngayı çıkarın ve manometre borusunu yeniden bağlayın. Basınç okumalarını etkinleştirmek için vanayı açın. Son olarak, örnekleme portunu bir şırınga kullanarak astarlayın.

Ardından, tüy bırakmayan bir mendili üç eşit parçaya kesin veya yırtın. Bir parçanın köşesini bir uç oluşturacak şekilde bükün ve kalan kanı emmek için enjeksiyon portuna yerleştirin. İkinci parçayı bükün.

Tuzlu suyla nemlendirin ve kalan tüm kanı çıkarmak için ıslak ucu porta yerleştirin. Limanda kalan tuzlu suyu emmek için üçüncü parçayı kullanın. Şimdi ventriküler destek cihazını veya VAD'yi düşük bir hızda çalıştırın ve pompa içinde sıkışan hava kabarcıklarını çıkarmak için yaklaşık beş saniye çalıştırın.

Pompayı durdurun. Torbada herhangi bir kabarcık varsa, hava alma işlemini tekrarlayın. Döngüdeki kanı dolaştırmak için pompayı düşük bir hızda yeniden başlatın.

Bir mililitre heparin sodyum, iki mililitre hazırlanan kalsiyum klorür çözeltisi ve 1.5 mililitre EDTA'yı ayrı tüplere aktarın. Döngüdeki kana heparin eklemek için, 75 ünite heparini bir mikropipete aspire edin ve aynı anda pipeti dağıtarak ve şırınga pistonunu dökülmeden çekerek üç mililitrelik bir şırıngaya dağıtın. Maddeleri bir şırınga ile ilmek içine uygulamak için üç musluğun enine portunu kullanın.

Musluk üzerindeki erkek yem kilidini, üstteki hava kabarcıklarını yakalamak için enjeksiyon portu yukarı bakacak şekilde çevirin. Şimdi şırıngayı, bağlantı noktası yukarı bakacak ve şırınga dikey olarak aşağı bakacak şekilde yem kilidi aracılığıyla enjeksiyon portuna takın. Şırınga pistonunu kanla doldurmak için çekin ve şırıngaya herhangi bir hava aspire ederken heparini kanla karıştırın.

Hava kabarcıklarının şırınganın üstüne yükselmesine izin verin. Daha sonra karışımı ilmeğin içine enjekte edin ve hava girmediğinden emin olun. Heparinize kanın porttaki boşlukla sınırlı kalmamasını sağlamak için şırınganın içine ve dışına dört ila beş kez kan alın.

Döngüdeki kanın aktif pıhtılaşma süresini veya ACT'sini titre etmek için, önce döngüdeki 150 mililitre kana 750 mikrolitre bir molar kalsiyum klorür çözeltisi ekleyin. Kan pıhtılaşmasını önlemek için, kalan havayı çıkardıktan sonra sıvıyı hızla enjekte edin. Alternatif olarak, erken pıhtılaşmayı azaltmak için şırıngadaki kalsiyum klorürü bir mililitre tris tamponlu salin ile seyreltin.

Enjekte edilen kalsiyum klorürün en az iki dakika dolaşmasına izin verdikten sonra, numune alma portuna bir mililitrelik bir şırınga takın. Limandaki durgun kanı temizlemek için 0,5 mililitre atık kan çekin ve atın. Daha sonra, örnekleme portuna yeni bir mililitrelik şırınga takın ve analiz için 0,5 mililitre kan alın.

Aktif pıhtılaşma süresini bir bakım noktası tam kan pıhtılaşma sistemi kullanarak ölçün. Örnekleme portunu daha önce gösterildiği gibi tüy bırakmayan mendiller kullanarak temizleyin. Hedef kalsiyum klorür konsantrasyonunu bildirmek için titrasyon değerlerine bakın.

300 saniyelik aktif bir pıhtılaşma süresi elde etmek için kalsiyum konsantrasyonunu kademeli olarak artırın. Döngüde 300 saniyelik ACT elde edildikten sonra in vitro tromboz testine başlayın. Rotor hızını değiştirerek ve Hoffman kelepçesini kullanarak direnci düzenleyerek pompayı istenen akış hızına ve basınca ayarlayın.

Daha önce gösterildiği gibi, döngüden bir kan örneği çekerek ve ACT cihazına bir damla kan koyarak her 15 dakikada bir ACT'yi ölçün. ACT 200 saniyenin altına düşerse, döngüye 25 birim daha heparin sodyum enjekte edin. Bir saat sonra, daha fazla pıhtılaşmayı önlemek için döngüye 1,5 mililitre 0,5 molar EDTA enjekte edin.

EDTA'nın dolaşmasına ve iki dakika karışmasına izin verin, ardından pompayı durdurun. Kanama durdurucuları kullanarak, pompa girişine ve çıkışına bağlı boruyu kelepçeleyin ve kelepçeleri giriş ve çıkış dikenlerinden üç ila dört santimetre uzağa yerleştirin. Pompayı serbest bırakmak için boruyu dikkatlice ayırın.

Ardından pompadaki kanı ve akış döngüsünü bir kaba boşaltın. Son olarak, kalan kanı yıkamak için pompa girişinden ve çıkışından tuzlu su pipetleyin. Trombosit birikimi, pompa prototiplerindeki bıçakların kökleri boyunca sürekli olarak gözlenmiştir.

Titanyum bileşenlerin elektro-parlatılması, bu bölgelerdeki trombüs oluşumunu ortadan kaldırdı. Prototip ayrıca ön ve arka gövde bileşeni bağlantısında kusurlu bir kooptasyona sahipti, bu da kanın sızdığı ve pıhtılaştığı bir yarığa neden oldu. Lepleme ve parlatma, bileşenlerin uyumunu iyileştirdi ve trombüs oluşumunu azalttı.

Prosedürel hatalar ve döngünün eksik bir şekilde havalandırılması artefaktlara neden olabilir. Bu durumda, kalsiyum klorür enjeksiyonu sırasında deneysel bir hata, lokalize pıhtılaşmayı tetikledi ve ortaya çıkan trombüs, akış yolunu tıkayarak santrifüj Maglev pompasına girdi. Yüzeylerde gözlenen küresel, gevşek yapışmış pıhtılar genellikle pıhtılar içinde kapsüllenen hava kabarcıklarının sonucudur.

Döngü içinde dolaşan yabancı madde ve döküntüler de trombüs içinde kapsüllendi ve pompa yüzeylerine yapıştırıldı. Boru konektör bağlantılarındaki halka trombüsler, test sırasında optimal ACT aralığının göstergesiydi.