Sarı Humma Sivrisineği Aedes aegypti'de CRISPR-Cas9 Kullanılarak Genom Düzenleme

Burada, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak sivrisinek A. aegypti'de embriyonik mikroenjeksiyon yoluyla genom düzenleme için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Araştırmamızın kapsamı, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak genetiği değiştirilmiş sivrisinek hatları oluşturmayı içermektedir. Sivrisinek popülasyonunun baskılanması, PgSIT'in yanı sıra gen ekspresyonunun mekansal zamansal kontrolü için ikili ekspresyon sistemlerinin kurulması için CRISPR-Cas9 teknolojisinin kullanılması.

CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak hem nakavt hem de nakavt hatları elde ettik. Knockin hatlarımız, dokuya özgü etiketleme ve nöronal aktivite raporlayıcıları G-CaMP6 için floresan belirteçler, GFP gibi aşağı akış genlerinin uzamsal zamansal kontrolüne izin veren QF transaktivatörünün yerleştirilmesini içerir.

Yeni sivrisinek mutant hatlarının kurulması, gen fonksiyonu ve sinir, fizyolojik ve davranışsal etkilerin daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlayacaktır. Bu, sivrisinek kaynaklı hastalık bulaşmasını önlemek için yeni yolların geliştirilmesine yol açabilir. Laboratuvarımız, erkek doğurganlığı ve dişi canlılığı ile ilgili genleri devre dışı bırakmak için CRISPR-Cas9 teknolojisine dayanan sivrisinek popülasyonunu bastırma teknolojisini geliştirdi. Ayrıca, sivrisinek duyusal dirençli, özellikle koku alma ve görme çalışmaları için birden fazla sivrisinek hattı kurduk.

[Görüşmeci] Nakavt mutantları için enjeksiyon yapısını hazırlamak için, Cas9 Seyreltme Tamponu kullanarak Cas9 proteinini istenen konsantrasyona seyreltin. Daha sonra in vitro sentezlenmiş kılavuz RNA veya gRNA'nın alikotunu ultra saf su ile seyreltin. Bir ribonükleoprotein kompleksi oluşturmak için seyreltilmiş Cas9 proteinini her gRNA ile önceden karıştırın. Daha sonra önceden karıştırılmış çoklu ribonükleoprotein kompleksi çözeltilerini birleştirin. Homolojiye yönelik onarım aracılı gen kaseti yerleştirmeleri için, Cas9 proteinini ve gRNA'ları seyreltin ve karıştırın. Donör plazmidini ultra saf suyla seyreltin ve tüm yapıları birleştirin. Ardından, mikroenjeksiyon iğnelerini hazırlamak için bir kuvars filament kullanın. Aşağıdaki programı kullanarak. İğneleri bir lazer mikropipet çektirme ile çekin. Manuel aspiratör kurduktan sonra, beyaz daire filtre kağıtlarını nemlendirin ve kollektörün içindeki iç duvara veya nemli pamuğun üzerine yerleştirin. Beş ila 10 gün önce kanla beslenen beş ila 10 dişi sivrisineği toplayıcıya yerleştirin. Ardından kollektörü 45 dakika karanlıkta bırakın. Daha sonra sivrisinekleri toplayıcıdan çıkarın. İnkübasyondan sonra, embriyoları hasat etmek için filtre kağıtlarını çıkarın. Hasat kağıdından açık gri olan blastoderm öncesi aşama embriyolarını seçin. Seçilen embriyoları ıslak bir fırça ile bir örtü astarının üzerine yerleştirilmiş çift taraflı yapışkan banda aktarın. Embriyoları paralel olarak hizalayın, çevreleri ıslak kalırken tüm arka uçları öne bakacak şekilde yan yana olduklarından emin olun. Hizalama sırasında, kurumayı önlemek için embriyoların üzerine Halokarbon Yağı 700 ekleyin. Mikroenjektör üzerinde 300 hektopaskal dengeleme basıncı ve 500 hektopaskal enjeksiyon basıncı ayarlayın. Bir mikro yükleyici kullanarak, enjeksiyon yapısının üç mikrolitresini bir iğneye yükleyin. Kapak fişini hizalanmış embriyolarla birlikte bir mikroskop lamına yerleştirin ve enjeksiyon için mikroskop altına yerleştirin. Daha sonra, embriyoların arka ucuna doğru 10 derecelik bir açıyla bir mikro manipülatör ile iğne tutucusuna bir iğne sabitleyin. Ucunu kapak kaymasının kenarına hafifçe dokundurarak iğneyi nazikçe açın. Daha sonra embriyoyu plazmit yapısı ile enjekte edin. Aedes agyptie sivrisineklerine enjeksiyon yapısı enjekte ettikten sonra, embriyoları çevreleyen yağı çıkarmak için tüy bırakmayan tek kullanımlık mendiller kullanın. Embriyoları durulamak için deiyonize su ekleyin. Durulanmış embriyoları ıslak bir filtre kağıdına aktarın ve filtre kağıdını Karat dokuz onsluk bir kabın içindeki ıslak bir doku üzerine yerleştirin. Ardından nemi korumak için bardağın dibine ıslak pamuk yerleştirin. Embriyoları üç ila dört gün nemli tuttuktan sonra, embriyolarla birlikte filtre kağıdını kuluçka için Sterilit altı litrelik bir tavada yaklaşık üç litre deiyonize suya aktarın. G zero larvaları yumurtadan çıktıktan sonra, tavaya suyla karıştırılmış balık yemi ekleyin. G zero larvalarını üçüncü ila dördüncü instar larva aşamasında floresan işaretleyici için tarayın. Larvaları floresan durumlarına göre ayırın. Floresan pozitif ve floresan negatif larvaları ayrı tavalarda tutun. Enjekte edilen sivrisinekleri pupa olduklarında cinsiyetlerine göre ayırın ve erkekleri daha küçük boyutları, daha belirgin ve sivri genital lobları ve daha geniş kürekleriyle tanımlayın. Dişileri daha büyük boyutları, daha az belirgin genital lobları ve daha dar kürekleri ile tanımlayın. Her cinsiyetten floresan pozitif veya floresan negatif sivrisinekleri bir araya getirdikten sonra, her bir havuzu, floresan taramalı her birey için üç ila beş vahşi tip birey oranında vahşi tip Liverpool A. agyptie türünden karşı cinsten sivrisineklerle geçin ve dört gün boyunca çiftleşmelerine izin verin. Üç ila dört gün sonra, G1 larvalarını üçüncü ila dördüncü instar larva aşamalarında floresan işaretleyici için tarayın.