Sarko-Endoplazmik Retikulum Ca²⁺-ATPazın Tavşan Kasından Saflaştırılması

Araştırmamız, trehalozun saflaştırma sırasında SERCA'yı stabilize edip etmediğini, stabilitesini ve işlevselliğini artırıp artırmadığını araştırırken, yüksek yapısal kalite ve katalitik aktivite ile SERCA'yı saflaştırmaya odaklanmaktadır. P-tipi ATPazların oligomerik durumlarındaki üç boyutlu yapısının belirlenmesi. ATPazların yapısal modellemesi, yapısal dinamik simülasyonları ve ligandların moleküler yerleştirilmesi için yapay zekanın kullanımı, hastalık terapötiklerini keşfetmek ve protein fonksiyon analizini ve daha yeni teknolojileri geliştirmek için. Mevcut zorluklar arasında P-ATPazlardaki enerji dönüşüm mekanizmalarının anlaşılması, kuaterner yapının fonksiyon ve aktiviteyi nasıl düzenlediğinin aydınlatılması ve insan hastalıklarında terapötik uygulama için etkili inhibitörlerin belirlenmesi yer almaktadır. GS plazma zarı proton-ATPaz'ın heksamerik durumunu doğruluyoruz ve Kramers'in teorisi tarafından tanımlandığı gibi yapısal dinamiklerini, bağımlılığını veya orta viskozitesini gösteriyoruz.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, vahşi tip Oryctolagus cuniculus'tan hızlı kasılan kas elde edin. Maserasyon için üç hacim 100 milimolar potasyum klorür içinde süspanse edin. Bir dakika karıştırın, ardından bir dakika buz gibi dinlenin. Doku kalıntılarını gidermek için numuneyi 4 santigrat derecede 1.500 g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir tüpe toplayın, ardından bir doku öğütücü ile homojenize edin. Daha sonra homojenatı ve ardından süpernatanı santrifüjleyin. Peletleri yaklaşık 40 mililitre 0.5 molar sükroz içinde askıya alın. Şimdi, süspansiyonu 12.000 g'da 4 santigrat derecede 15 dakika santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı santrifüjlemeden önce 0.6 molar potasyum klorür ve 0.15 molar sükroz ile seyreltin. Sarkoplazmik retikulum vezikül tabakaları içeren peleti, pH 7.0'da 0.3 molar sükroz, 0.1 molar potasyum klorür ve 5 milimolar Tris-hidroklorür içeren bir tamponda askıya alın. Sarkoplazmik retikulum veziküllerini 1 mililitrelik hacimlerde alikotlayın. Sarkoplazmik retikulum vezikül süspansiyonunu hafif çalkalama ile 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin, ardından santrifüjleyin. Peleti 3 mililitreden daha az 25 milimolar Tris-hidroklorür tamponunda askıya alın. Süspansiyonu homojenize ettikten sonra, Tris-hidroklorür tamponu ile 10 mililitrelik son hacme ayarlayın. Lowry testini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin. Mililitre başına 5 miligram azolektin ekleyin ve ardından 0.85 Zwittergent 3-14 ekleyin. Süspansiyonu tekrar homojenize edin ve 100.000 g'da 4 santigrat derecede 60 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı yeni bir tüpte toplayın. pH 7.2'de 2 milimolar EGTA ile 1 ila 2 oranında seyreltin. Süspansiyonu, Tris tamponundaki süreksiz bir trehaloz konsantrasyon gradyanı üzerine yavaşça dökün. Daha sonra daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve şeffaf, hafif sarı peleti toplayın. Peletleri küçük bir hacimde Tris tamponunda nazikçe askıya alın. Protein konsantrasyonunu ölçün, ardından protein konsantrasyonunu mililitre başına 2 miligrama ayarlamak için seyreltin. ATPaz aktivitesi için 1 mililitre reaksiyon karışımı hazırlayın. Homojenize etmek için reaksiyon testini girdaplayın, ardından 37 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. 0.9 birim L-laktat dehidrojenaz ve 1.5 birim piruvat kinaz ekleyin. ATPaz reaksiyonunu başlatmak için 10 mikrogram SERCA ekleyin. NAD oluşumunu belirlemek için termostatik hücre tutucuya sahip bir spektrofotometre ile 340 nanometrede 600 saniye boyunca her saniye absorbans değişimini izleyin. SERCA'nın floresein izotiyosiyanat veya FITC ile etiketleme tahlili için, önce 50 mikrolitre etiketleme tamponunda 20 mikrogram SERCA'yı askıya alın. İyi karıştırmak için girdap. Daha sonra numuneleri karanlıkta oda sıcaklığında 15, 10, 7, 5 ve 2 dakika inkübe edin. Etiketleme reaksiyonunu durdurmak için eşit hacimde buz gibi soğuk durdurma tamponu ekleyin. Karanlıkta buz üzerinde 5 dakika inkübe edin. FITC etiketli SERCA'yı SDS-PAGE'e tabi tutun. Berrak jelleri 302 nanometre dalga boyunda ultraviyole ışığa maruz bırakın ve sonucu fotoğrafla belgeleyin. Son olarak, jeli Coomassie mavisi ile boyayın. Sonucu fotoğrafla belgeleyin. Dairesel dikroizm spektrum analizi için, önce SERCA'yı 25 santigrat derecede pH 7.0 olan 400 mikrolitre 10 milimolar fosfat tamponunda askıya alın. Numuneyi, yol uzunluğu 0,1 santimetre olan bir hücreye yükleyin. Şimdi, uzak ultraviyole spektrum aralığını 190 ila 260 nanometre arasında ve dahili çözünürlüğü ve bant genişliğini 1 nanometre olarak ayarlayın. Dairesel dikroizm sinyalini 25 santigrat derecede dakikada 50 nanometre hızında kaydedin. Coomassie mavisi lekeli SDS-PAGE jeli, saflaştırma ilerledikçe SERCA protein bandının zenginleştiğini gösterdi. Bir trehaloz konsantrasyon gradyanı üzerinde ultrasantrifüjleme kullanan son SERCA saflaştırma adımı,% 90'ı aşan bir saflık ile sonuçlandı. Sarkoplazmik retikulum vezikülleri, bu P-ATPaz'a karşılık gelen veziküllerdeki toplam proteinin yaklaşık% 73'ü ile yüksek miktarda SERCA içeriyordu. ATP hidroliz hızına karşı ATP konsantrasyon eğrisinde saflaştırılmış SERCA için bir Michaelis-Menten kinetik modeli gözlendi ve bu da enzimatik işlevselliğini doğruladı. Lineweaver-Burk grafiği, daha önce bildirilen değerlerle tutarlı olarak, ATP için yaklaşık 10 mikromollük bir Michaelis sabiti ortaya çıkardı. SERCA'nın FITC etiketlemesi, sağlam bir nükleotid bağlanma bölgesini gösterdi. Coomassie mavisi lekeli SERCA bandı, FITC etiketli banda tam olarak karşılık geliyordu. Dairesel dikroizm spektroskopisi, saflaştırılmış SERCA'nın yüksek yapısal kalitesini doğruladı ve spektrumu iyi tanımlanmış ikincil yapı elemanlarını gösterdi.