Name: Sarko-Endoplazmik Retikulum Ca2+-ATPazın Tavşan Kasından Saflaştırılması (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Keşfedin tavşan kasından SERCA saflaştırma yöntemini, trehaloz kullanarak yüksek saflık ve katalitik aktivite elde edin. Bu biyokimyasal teknik yapısal biyoloji araştırmaları için idealdir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Tüm hayvan prosedürleri, deney laboratuvarlarında hayvanların işlenmesine ilişkin uluslararası ve yerel (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) yönergelere uygun olarak gerçekleştirildi 51,67,68. Kas dokusu, yerel bir hayvan işleme ünitesinden (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46 vahşi tip Oryctolagus cuniculus'tan elde edildi. Laboratuvar hayvanı yönetiminde uzmanlığa sahip bir veteriner, ilk kas diseksiyonunu ve işlemesini gerçekleştirdi. Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
1. Sarkoplazmik retikulumun hızlı kasılan tavşan kasından izolasyonu (Zamanlama, 7 - 9 saat)
NOT: Prosedürle ilgili ayrıntılar için Champeil ve ark.69'a bakın.
<ol>
	<li>Yabani tip Oryctolagus cuniculus'tan hızlı kasılan kas dokusu (hayvan başına her iki arka bacağından ~ 70 g) elde edin. NOT: Diseke edilecek kasların önceden görsel olarak tanımlanması gereklidir70,71.</li>
	<li>Hızlı kasılan kası, 1 dakika açık ve 1 dakika buz gibi soğuk dinlenme ile 100 mM KCl'lik üç hacimde süspanse ederek bir karıştırıcıda yumuşatın, üç kez tekrarlayın72.</li>
	<li>Doku kalıntılarını santrifüjleme (1500 × g) ile 4 ° C'de 5 dakika uzaklaştırın; Gerekirse ikinci bir santrifüjleme (4200 × g) yapılır.</li>
	<li>Süpernatanı toplayın ve bir doku öğütücü kullanarak homojenize edin (düşük hızda 10 vuruş, yani 500-1.500 rpm)72,73. Homojenatı (10.000 × g) 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. NOT: Nispeten yüksek bir hızın kullanılması sisteme ve operatöre zarar verebileceğinden, homojenizasyon sırasında dikkatli olunmalıdır.</li>
	<li>Süpernatanı (sarkoplazmik retikulum içeren) (33.000 × g) 4 ° C'de 120 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Peletleri 40 mL 0,5 M sükroz ve santrifüj (12.000 × g) içinde 4 ° C'de 15 dakika süreyle askıya alın. Süpernatanı seyreltin (0.6 M KCl ve 0.15 M sükroz) ve süspansiyonu (34.000 × g) 4 ° C'de 165 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Sarkoplazmik retikulum vezikülleri (SRV'ler) tabakalarını içeren peleti 0.3 M sakaroz, 0.1 M KCl ve 5 mM Tris-HCl, pH 7.0 içinde askıya alın. Protein standardı olarak Lowry testi74 ve insan serum albüminini kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.</li>
	<li>SRV'leri (30-32 mg / mL) 1 mL hacimde ayırın. SRV numunelerini daha sonraki işlemler için -72 °C'de saklayın. NOT: Protein verimi hayvan başına 100-110 mg SRV'dir.</li>
</ol>
2. SERCA arıtma (Zamanlama, 18 - 20 saat)
NOT: Prosedürle ilgili ayrıntılar için Rivera-Morán ve ark.46'ya bakın.
<ol>
	<li>Buz gibi 75 mM Tris-HCl, pH 7.2, 0.6 M KCl, 6 mM EDTA, 1 mM EGTA ve% 0.1 (a/h) deoksikolat (DOC) kullanarak SRV süspansiyonunu 2 mg protein / mL'ye seyreltin. SRV'lerin süspansiyonunu buz üzerinde 10 dakika inkübe edin ve hafifçe çalkalayın. SRV'nin süspansiyonunu (100.000 × g) 4 ° C'de 60 dakika santrifüjleyin. NOT: DOC damla damla eklenmelidir.</li>
	<li>Peletleri &lt;3 mL 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M KCl, E gliserol (h/h) ve 2 mM EDTA içinde askıya alın. Süspansiyonu homojenize edin ve 10 mL'lik bir nihai hacme ayarlayın. Protein konsantrasyonunu belirleyin ve ardından 6.5 mg / mL'ye ayarlayın. 5 mg / mL ve 0.85 (a / a) Zwittergent 3-14'te azolektin ekleyin. NOT: Azolektin ve Zwittergent 3-14 damla damla eklenmelidir.</li>
	<li>Süspansiyonu ve santrifüjü (100.000 × g) 4 °C'de 60 dakika boyunca homojenize edin. Süpernatanı toplayın ve 1:2'yi 2 mM EGTA (pH 7.2) ile seyreltin.</li>
	<li>Süspansiyonu 10 mM Tris-HCl, pH 7.0, 1 mM EDTA, %0.1 deoksikolat ve 1 mg / mL azolektin içinde süreksiz bir trehaloz konsantrasyon gradyanına (45, 40, 35 ve 0 a/h) yavaşça dökün. Santrifüj (100.000 × g) 4 ° C'de 14 saat. Tüplerin dibinde oluşan şeffaf, hafif sarımsı peleti toplayın. NOT: Hem trehaloz gradyanının oluşumu hem de numune süspansiyonunun eklenmesi uygun teknikler kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Gece santrifüjleme önerilir.</li>
	<li>Peleti 25 mM Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M KCl, E gliserol ve 2 mM EDTA'dan oluşan küçük bir hacimde (&lt;1.5 mL) nazikçe askıya alın. Protein konsantrasyonunu belirleyin. Protein konsantrasyonunu 2 mg / mL'ye seyrelterek ayarlayın. Süspansiyonun alikotlarını (~ 50 μL) alın ve saflaştırılmış SERCA'yı kullanılana kadar -72 ° C'de saklayın.</li>
	<li>Saflaştırılmış SERCA72'nin ve farklı saflaştırma adımlarında alınan protein numunelerinin SDS-PAGE'sini gerçekleştirin. Jeli Coomassie Blue72 ile boyayın. NOT: Süspansiyon tamponunda gliserol yerine 0,6 M trehaloz kullanılması, depolama ve donma-çözülme döngüleri28,29 sırasında enzimin stabilitesini arttırır.</li>
</ol>
3. ATPaz aktivitesi için test (Zamanlama, 1 - 2 saat)
<ol>
	<li>Enzim bağlı deney: ATPaz-Piruvat kinaz-laktat dehidrojenaz<ol>
		<li>Reaksiyon karışımını hazırlayın (1 mL): 50 mM MOPS (pH 7.0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 5 mM fosfoenolpiruvat, 250 μM NADH. Değişken ATP konsantrasyonlarını (0,001 ila 0,25 mM) dahil edin.</li>
		<li>Reaksiyon tahlilini girdaplama ile dikkatlice homojenize edin. Reaksiyon testini 37 ° C'de 10 dakika inkübe edin. 0.9 U L-laktat dehidrojenaz (LDH) ve 1.5 U piruvat kinaz (PK) ekleyin.</li>
		<li>10 μg SERCA ilavesiyle ATPaz reaksiyonunu başlatın.</li>
		<li>NADH'nin oluşumunu belirleyin. Termostatlı hücre tutuculu bir spektrofotometre kullanarak zaman içinde 340 nm dalga boyunda (λ) 600 s boyunca her saniye absorbans yoğunluğundaki değişimi takip edin. NOT: Absorbans ölçümü için zaman aralığı değişebilir, ancak ATPase reaksiyonunun ilk düz çizgisini çizmek için mümkün olduğunca çok veri noktası kaydetmeye çalışın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>ATP hidroliz oranını belirleyin NOT: Prosedürle ilgili ayrıntılar için Rivera-Morán ve ark.46'ya bakın.<ol>
		<li>Oluşturulan her eğrideki doğrusal kısmın eğim değerini (Δabs/dak) hesaplayın. ATPaz aktivitesini (μmol ATP hidrolize / min.mg prot) belirlemek için NADH'nin (λ = 6.220 M−1·cm−1) molar sönme katsayısını (ε) kullanın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Km ve Vmax kinetik parametrelerini belirleyin
	<ol>
		<li>Veri analizi ve grafik yazılımı kullanarak ATP konsantrasyonuna karşı hız verilerini çizin.</li>
		<li>Verileri doğrusal olmayan regresyon yoluyla Michaelis-Menten Denklemine (Eşitlik 1)46 sığdırın: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67748/67748eq01.jpg" style="margin: auto;"> burada v hız, Vmaks maksimum hız, [S] ATP konsantrasyonu ve Km Michaelis-Menten sabitidir.</li>
		<li>Yineleme ile K,m ve Vmax'ı belirleyin. NOT: DOC'un dahil edilmesi ATPaz oranı yanıtını artırabilir; Optimumu bulmak için farklı DOC konsantrasyonlarının test edilmesi önerilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. SERCA'nın Floresein İzotiyosiyanat (FITC) ile etiketleme deneyi (Zamanlama, 30 - 45 dakika, sadece FITC etiketlemesi için)
NOT: Prosedürle ilgili ayrıntılar için 54,75,76'ya bakın.
<ol>
	<li>1 mM FITC içeren 50 μL (son hacim) etiketleme tamponunda (100 mM KCl, 5 mMMgCl2 ve 30 mM Tris-HCl, pH 8.9) SERCA'yı (20 μg) askıya alın. Girdap yaparak karıştırın.</li>
	<li>Numuneleri karanlıkta ve oda sıcaklığında farklı zamanlarda (15 dakika, 10 dakika, 7 dakika, 5 dakika ve 2 dakika) inkübe edin.</li>
	<li>ATP (5 mM) içeren 1 hacim buz gibi soğuk durdurma tamponu (480 mM sükroz ve 48 mM MOPS, pH 7.0) ekleyerek etiketleme reaksiyonunu durdurun. Karanlıkta 5 dakika buz üzerinde kuluçkaya yatırın.</li>
	<li>FITC etiketli SERCA'yı SDS-PAGE72'ye tabi tutun. Berrak jelleri UV ışığına maruz bırakın (λ = 302 nm). Sonucu fotoğrafla belgeleyin.</li>
	<li>Jeli Coomassie mavisi ile boyayın. Sonucu fotoğrafla belgeleyin. NOT: FITC etiketlemesinin karanlık bir odada yapılması floresan sinyalinin kalitesini artırabilir.</li>
</ol>
5. Dairesel dikroizm (CD) spektrumları (Zamanlama, 30 dk)
NOT: Prosedürle ilgili ayrıntılar için 11,77'ye bakın.
<ol>
	<li>SERCA'yı (3 μM) 25 ° C'de 400 μL 10 mM fosfat tamponunda (pH 7.0) askıya alın.</li>
	<li>Numuneyi 0,1 cm yol uzunluğunda bir hücreye yükleyin. Uzak UV spektrumları λ aralığını 190-260 nm arasında ayarlayın. Dahili çözünürlüğü ve bant genişliğini 1 nm olarak ayarlayın.</li>
	<li>CD sinyalini 25 °C'de 50 nm/dk'da kaydedin.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr>Soya fasulyesi <td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>44924</td><td></td>Tezgah Üstü UV<td>aydınlatıcıdan Azolektin</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-97623-08</td><td>Çift yoğunluklu Yüksek ayar, analitik dokümantasyon için idealdir. Düşük ayar, hazırlık çalışması yaparken jel numunelerinin fotoniklenmesini veya foto ağartılmasını azaltır.</td></tr><tr><td>CaCl2 & boğa; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Coolpix B500 kamera&nbsp;</td><td>Nikon Corp</td><td>S210</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie parlak mavi G-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610406</td><td></td></tr><tr><td>Dodesil maltosid</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis (2-aminoetileter) - N, N, N ve prime;, N & prime; -tetraasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit tetrasodyum tuzu dihidrat&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>Floresein izotiyosiyanat</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>F3651</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>JT Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl 2 & boğa 6H 2 O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Chem-Impex Uluslararası Inc</td><td>230</td><td></td></tr><tr><td> N -tetradesil- N, N- dimetil-3-amonyum-1-propansülfonat</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D0431</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolpiruvat (PEP)</td> <td>Chem-Impex International Inc</td><td>9711</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan kası laktat dehidrojenaz</td><td>Roche</td><td>10003557103</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan kası piruvat kinaz</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum deoksikolat</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td></td></tr><tr><td>Spektropolarimetre&nbsp;</td><td>Jasco A.Ş.</td><td>Jasco J1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Trehaloz</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>T0167</td><td>Dihidrat</td></tr><tr><td>Tris (hidroksimetil) aminometan hidroklorür</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasantrifüj</td><td>Beckman</td><td>Optima XPN</td><td></td></tr><tr><td>UV / VIS spektrofotometresi ve nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>8453</td><td>Agilent 8453 UV-Vis Spektrofotometresi, tüm ultraviyole ve görünür ışık spektrumunun eş zamanlı ölçümü için bir fotodiyot dizisi kullanır</td></tr><tr><td>WiseStir HS- 30E</td><td>Daihan Scientific Co.</td><td>Dh. WOS01010</td><td>Tüm dağıtma ve homojenleştirme uygulamaları için idealdir, doku öğütücüler için tasarlanmıştır.</td></tr></tbody></table>

sarko-endoplazmik retikulum ca2+-atpazın tavşan kasından saflaştırılması

Purification of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase from Rabbit Muscle

Saflaştırmanın farklı aşamalarında SERCA'nın SDS-PAGE'i (Şekil 1). Coomassie mavisi lekeli jel, saflaştırma protokolü ilerledikçe SERCA protein bandının (görünür moleküler ağırlık &gt;100 kDa) zenginleşmesini gösterir. SERCA'ya karşılık gelen protein bandı, bir trehaloz konsantrasyon gradyanı üzerinde santrifüjlemeden sonra% &gt;90'lık bir saflık gösterir. ATP konsantrasyonuna karşı ATP hidroliz hızının grafiği (Şekil 2A). Saflaştırılmış SERCA için Mich...

Sarko-Endoplazmik Retikulum Ca2+-ATPazın Tavşan Kasından Saflaştırılması

Some P-type ATPases, such as sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase (SERCA), are inherently labile membrane proteins that require specific ...

purification-sarco-endoplasmic-reticulum-ca2-atpase-from-rabbit

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Xenopus oositlerindeki enzimlerin heterolog ekspresyonu ve atomik absorpsiyon spektrofotometrisi ile tek tek hücrelere Rb+ veya Li+ alımını ölçerek K+-karşı taşıyıcı P-tipi ATPazların aktivitesini ölçmek için bir yöntem açıklıyoruz. Yöntem, karmaşık kinetik çalışmaları kolaylaştıran radyoizotop akı deneylerine hassas ve güvenli bir alternatiftir.

Na, K ve H, K-ATPaz bölgesindeki tarafından Katyon Taşıma Ölçüm<em&gt; Xenopus</emAtomik Absorpsiyon Spektrofotometresi ile&gt; Oosit: Radyoizotop Tahliller Alternatif Bir

Bu makalede, Langendorff-perfüze tavşan kalbinde ayrıntılı protokol ve transmembran potansiyeli (V m) ikili optik haritalama ve ücretsiz içi sarkoplazmik retikulum (SR) için gerekli donanımın Ca 2+ açıklanır. Bu yöntem, sağlam kalbinde, doğrudan gözlem ve V m ölçümü ve SR Ca 2 + dinamikleri sağlar.

Intra-Sarkoplazmik Retikulum Ca Optik Haritalama<sup&gt; 2+</sup&gt; Ve Langendorff-perfüze Tavşan Heart Transmembran Potansiyeli

Endoplazmik retikulum kalsiyum homeostazı çeşitli patolojilerde bozulur.  ER kalsiyum deposundaki bozulmaları tespit etmek için salgılanan bir ER kalsiyum izleme proteini (SERCaMP) raportörü kullanılabilir.   Bu protokol, ER kalsiyum homeostazını in vitro ve in vivo olarak incelemek için bir Gaussia lusiferaz SERCaMP'nin kullanımını açıklar.

Bir kullanılması Endoplazmik retikulum kalsiyum dengesi İzleme<em&gt; Gaussia</em&gt; Lusiferaz SERCaMP

Şu anda, mevcut kalsiyum indikatörlerinin çoğu, kültürlenmiş düz kas hücrelerinde sarkoplazmik retikulumdan salınan kalsiyumun dolaylı ölçümleri olarak sitoplazmik kalsiyum geçişlerini ölçmek için kullanılmaktadır. Bu protokol, sarkoplazmik retikulum lümeni içindeki kalsiyum sinyallerinin doğrudan ölçülmesine izin veren spesifik bir FRET tabanlı göstergenin kullanımını açıklar.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Hücre içi kalsiyum geri dönüşüm cardiomyocytes sistolik ve diyastolik fonksiyon yönetmelikte kritik bir rol oynamaktadır. Burada, sarcoplasmic retikulum Ca2 + rezerv ve diyastolik kalsiyum kaldırma cardiomyocytes işlevinde bir kalsiyum görüntüleme sistemi tarafından değerlendirmek için bir protokol açıklayın.

Sarcoplasmic retikulum kalsiyum koruma ve hücre içi diyastolik kalsiyum kaldırma izole Ventriküler Cardiomyocytes olarak değerlendirilmesi

HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.

Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup&gt; 2+</sup&gt; Sensör Catcher<sup&gt; +</sup

Bu iletişim kuralı F1arıtma açıklar-ATPaz Trypanosoma bruceikültürlü böcek sahneden. Yordamı son derece saf, homojen ve aktif karmaşık yapısal ve enzimatik araştırmaları için uygun verir.

Yalıtım F1-ATPaz paraziter Protist Trypanosoma brucei üzerinden

Mitokondri, iskelet kasında yüksek düzeyde fenotipik plastisite gösteren anahtar metabolik organellerdir. Sitozolden protein ithalatı, retikülün genişlemesi ve mitokondriyal fonksiyonun sürdürülmesi için gerekli olan organel biyogenez için kritik bir yoldur.  Bu nedenle, protein ithalatı hücresel sağlığın barometresi olarak hizmet eder.

İskelet Kas Mitokondrilerinin Protein İthalat Kapasitesinin Ölçümü

İşlevsel bölgeye yönelik florometri, protein alanı hareketlerini gerçek zamanlı olarak incelemek için kullanılan bir yöntemdir. Bu tekniğin doğal hücrelerde uygulanması için modifikasyonu, artık murin izole iskelet kası liflerindeki voltaj kapılı Ca2 + kanallarından tek voltaj sensörü hareketlerinin tespit edilmesine ve izlenmesine izin vermektedir.

İskelet Kas Uyarılabilirliğini Incelemek için Doğal Hücrelerde Fonksiyonel Bölgeye Yönelik Florometri

Bu protokol, MultiBac Baculovirus sistemini kullanarak insan miyozin-7a holoenziminin rekombinant olarak üretilmesi ve özel bir in vitro filament kayma testi kullanılarak motilitesinin incelenmesi prosedürlerini detaylandırır.

İnsan Miyozin-7a'nın MultiBac Sistem Tabanlı Saflaştırılması ve Biyofiziksel Karakterizasyonu

Keşfedin tavşan kasından SERCA saflaştırma yöntemini, trehaloz kullanarak yüksek saflık ve katalitik aktivite elde edin. Bu biyokimyasal teknik yapısal biyoloji araştırmaları için idealdir.

Sarko-Endoplazmik Retikulum Ca²⁺-ATPazın Tavşan Kasından Saflaştırılması

Daha fazla video keşfet