Name: Erken Evre Zebra Balığı Larvalarında Küçük Molekül Taraması ve Toksisite Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-07T14:10:00.000+00:00
Duration: 2 min 52 s
Description: Keşfedin küçük molekül taraması ve toksisite testi yöntemini Danio rerio larvalarında morfolojik değerlendirme için. Bu protokol ilaç etkilerini ve gelişimsel toksisiteyi analiz etmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Teame, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+as+biomedical+models%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Front%22%5BJournal%5D)">The use of zebrafish (Danio rerio) as biomedical models.</a> Anim Front. 9 (3), 68-77 (2019).</li>
<li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li>
<li>Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+disease+models+in+drug+discovery%3A+From+preclinical+modelling+to+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Zebrafish disease models in drug discovery: From preclinical modelling to clinical trials.</a> Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).</li>
<li>Clift, D., Richendrfer, H., Thorn, R. J., Colwill, R. M., Creton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+behavior+in+zebrafish+larvae%3A+Effects+of+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of behavior in zebrafish larvae: Effects of feeding.</a> Zebrafish. 11 (5), 455-461 (2014).</li>
<li>Keenan, S. R., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developmental+phases+of+zebrafish+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developmental phases of zebrafish myogenesis.</a> J Dev Biol. 7 (2), 12(2019).</li>
<li>Tonelli, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+A+resourceful+vertebrate+model+to+investigate+skeletal+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: A resourceful vertebrate model to investigate skeletal disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 489(2020).</li>
<li>OECD. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Test+no.+236%3A+Fish+embryo+acute+toxicity+%28FET%29%22">Test no. 236: Fish embryo acute toxicity (FET)</a>. , (2013).</li>
<li>Chen, J. R., Lai, Y. H., Tsai, J. J., Hsiao, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+fluorescent+staining+platform+for+drug-screening+and+mechanism-analysis+in+zebrafish+for+bone+mineralization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Live fluorescent staining platform for drug-screening and mechanism-analysis in zebrafish for bone mineralization.</a> Molecules. 22 (12), 2068(2017).</li>
<li>He, H., Wang, C., Tang, Q., Yang, F., Xu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Possible+mechanisms+of+prednisolone-induced+osteoporosis+in+zebrafish+larva%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Possible mechanisms of prednisolone-induced osteoporosis in zebrafish larva.</a> Biomed Pharmacother. 101, 981-987 (2018).</li>
<li>Huang, H. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+bone+transgenic+zebrafish+in+anti-osteoporosis+chemical+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Animal+Model+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Application of bone transgenic zebrafish in anti-osteoporosis chemical screening.</a> Animal Model Exp Med. 1 (1), 53-61 (2018).</li>
<li>Haney, M. G., Moore, L. H., Blackburn, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+screening+of+primary+patient+derived+tumor+xenografts+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Drug screening of primary patient derived tumor xenografts in zebrafish.</a> J Vis Exp. (158), e60996(2020).</li>
<li>Nishimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+zebrafish+in+systems+toxicology+for+developmental+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Congenit+Anom+%28Kyoto%29%22%5BJournal%5D)">Using zebrafish in systems toxicology for developmental toxicity testing.</a> Congenit Anom (Kyoto). 56 (1), 18-27 (2016).</li>
<li>Hayot, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+toxicity+of+chemicals+using+a+zebrafish+vibration+startle+response+screening+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Evaluating toxicity of chemicals using a zebrafish vibration startle response screening system.</a> J Vis Exp. (203), e66153(2024).</li>
<li>Hoyberghs, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DMSO+concentrations+up+to+1%25+are+safe+to+be+used+in+the+zebrafish+embryo+developmental+toxicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Toxicol%22%5BJournal%5D)">DMSO concentrations up to 1% are safe to be used in the zebrafish embryo developmental toxicity assay.</a> Front Toxicol. 3, 804033(2021).</li>
<li>Lipton, J. H., Brümmendorf, T. H., Sweet, K., Apperley, J. F., Cortes, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+considerations+in+the+management+of+patients+treated+with+bosutinib+for+chronic+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Hematol%22%5BJournal%5D)">Practical considerations in the management of patients treated with bosutinib for chronic myeloid leukemia.</a> Ann Hematol. 103 (9), 3429-3442 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.5 mL mikrosantrifüj tüpü</td><td>Starlab</td><td>E1415-1510</td><td></td></tr><tr><td>10 & mikro; L mikropipet (P10)</td><td>Gilson</td><td>F144802&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10/20 ve mikro; L pipet uçları</td><td>Starlab</td><td>S1110-3810</td><td></td></tr><tr><td>1000 & L mikropipet (P1000)</td><td>Gilson</td><td>F123602&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 ve mikro; L pipet uçları</td><td>Starlab</td><td>S1111-6001</td><td></td></tr><tr><td>12 oyuklu plaka</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7512</td><td>Steril, tek sarılı, işlem görmemiş, kapaklı</td></tr><tr><td>20 ve mikro; L mikropipet (P20)</td><td>Gilson</td><td>F123600&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 ve mikro; L mikropipet (P200)</td><td>Gilson</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>200 ve mikro; L çok kanallı pipet&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F81024</td><td></td></tr><tr><td>200 ve mikro; L pipet uçları</td><td>Starlab</td><td>S1113-1006</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>Starlab</td><td>CC7672-7596</td><td>Steril, tek sarılı, düz tabanlı, işlenmemiş, kapaklı</td></tr><tr><td>İç ızgara eğimli tabanlı yetiştirme tankları, tank bölücüler ve kapaklar</td><td>Tecniplast</td><td>ZB17BTISLOP, ZB17BTE,&nbsp; ZB17BTL, ZB17BTD</td><td>Eğimli iç tank</td></tr>, <tr><td>File süzgeç/</td><td></td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Nitril eldiven</td>, <td>Mercator</td><td>/</td><td>/</td></tr><tr><td>Petri-kabı&nbsp;</td><td>Starlab</td><td>CC7672-3394/CC7672-3359</td><td>100 x 20 mm veya 60 x 15 mm</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica M205 FCA Floresan stereo mikroskop</td><td>Leica</td><td>10450826</td><td></td></tr><tr><td>Işık modüllü 2 raf içeren Peltier soğutmalı inkübatör soğuk beyaz</td><td>Memmert</td><td>IPP110ecoplus, T8</td><td>Gündüz/gece döngüsü</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sülfoksit ile donatılmıştır</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>504341000</td> E3 Kalsiyum klorür dihidrat <td>içinde %1'lik bir çözelti hazırlamak</td></tr> için <tr><td></td><td>Biochem Chemopharma</td><td>303080500</td><td>E3</td></tr><tr><td>Magnezyum sülfat heptahidrat</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>313060500</td> hazırlamak <td>için E3</td></tr><tr><td>Potasyum Klorür</td><td>Biochem Chemopharma</td><td>hazırlamak 316030500</td><td>E3</td></tr><tr><td>SCREEN-WELL&nbsp; Wnt Pathway kütüphanesi (Bosutinib)</td><td>Enzo</td><td>BML-2838-0500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S/3161/53</td><td>E3'ü hazırlamak için</td></tr></tbody></table>

erken evre zebra balığı larvalarında küçük molekül taraması ve toksisite testi

Small Molecule Screening and Toxicity Testing in Early-stage Zebrafish Larvae

Anormallikler, 7 dpf'ye kadar deneysel zaman çizelgesi boyunca tek tek veya kümülatif olarak incelenebilir. Anormallik başına maksimum morfoloji skoru, kullanılan larva sayısının yüzdesi olarak morfolojik anormallikleri hesaplamak için kullanılabilir. Örneğin, 7. günde perikardiyal ödem morfoloji skorları, olası 24 skor üzerinden 1 ve 2 skorerleri için sırasıyla 19 ve 20 ise, yani 24 üzerinden 19 veya 20 larva perikardiyal ödem gösterir, yüzde skoru şu şekilde hesaplanabilir:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67759/67759eq1.jpg">
Ek Tablo S1 , kronik miyeloid lösemi15 tedavisi için endike olan bir tirozin kinaz inhibitörü olan Bosutinib bileşiği için toksisite testini takiben 4 dpf'de morfoloji puanlama sonuçlarını (her iki skorerin) göstermektedir. Aynı morfoloji puanlaması, 5 dpf ila 7 dpf arasındaki maruz kalan balıklar için tekrarlanır. Bileşik, 100 μM ila 6.25 μM arasında bir konsantrasyon aralığı kullanılarak test edildi. Farklı zaman noktalarında üç teknik kopya gerçekleştirildi ve larvaların% 50'sinin hayatta kaldığı konsantrasyon olan LC50'yi belirlemek için 7 dpf'deki ortalama kümülatif mortalite oranı kullanıldı. LC50 , herhangi bir maruz kalma zaman noktasında belirlenebilir. Ancak, bunu 7 dpf'de hesaplamanızı öneririz.
7 dpf'deki kümülatif ortalama mortalite, Şekil 3'te görülebilen bir LC50 eğrisi oluşturmak için kullanıldı. Bosutinib için LC50 konsantrasyonunun 37.95 μM olduğu tahmin edildi.
NOT: Bu tahmini LC50 konsantrasyonu kesinlikle bu model sistem için geçerlidir ve daha sonra daha sonraki aşağı akış fenotipleme testleri için kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig1.jpg"> 
Şekil 1: Larvalarda 3-7 dpf'de önerilen ilaç taramasının şeması. 96 oyuklu test plakaları, Bosutinib bileşiği için 100 μM ila 6.25 μM arasında değişen beş konsantrasyonun araştırılması için kurulmuştur. Kısaltma: dpf = döllenmeden sonraki gün sayısı. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig2.jpg"> 
Şekil 2: Çeşitli kimyasal konsantrasyonlara maruz kalan 5 dpf'de (maruziyetten 2 gün sonra) zebra balığı larvalarında gözlenen temsili morfolojik kusurlar. (A) Kontrol (etkilenmemiş) zebra balığı, (B) Hafif perikardiyal ödem gösteren zebra balığı larvaları, (C) Şiddetli perikardiyal ödem ve yumurta sarısı kanaması olan zebra balığı, (D) Gelişimsel gecikmeli, pigmentasyonu azalmış, küçük yüzme keseli zebra balığı, (E) Şişmiş sarısı ve kuysal yüzgeci olan zebra balığı, (F) Kuyruk yüzgeci olmayan zebra balığı, (G) Kavisli notokordlu zebra balığı, (H) Kesik kuyruklu zebra balığı, ve (I) Nekrozlu ölü zebra balığı. Kusurlar kırmızı ok uçları ile belirtilmiştir. Ölçek çubukları = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67759/67759fig3.jpg"> 
Şekil 3: % mortaliteye karşı konsantrasyonu gösteren LC50 eğrisi. Test edilen beş konsantrasyon 100 μM, 50 μM, 25 μM, 12.5 μM ve 6.25 μM idi ve % mortalite sırasıyla% 100,% 100,% 29.2,% 12.5 ve% 12.5 idi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/67759fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Morfolojik Kusurlar</td>
			<td>Açıklama</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perikardiyal ödem</td>
			<td>Kalbin gerilmesi ve kan dolaşımının bozulması ile kalbin etrafında sıvı birikmesi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kalp atışları (dakika başına)</td>
			<td>Dakikadaki vuruş sayısında azalma</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yumurta sarısı</td>
			<td>Kardiyak defektlerle aynı anda ortaya çıkabilen yumurta sarısı ödemi veya kanamasının varlığı veya yokluğu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sarısı uzatma</td>
			<td>Şişmiş, ince veya olmayan yumurta sarısı</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kavisli notokord</td>
			<td>Bükülmüş veya dalgalı bir notokord ve/veya kıvrık kuyruk varlığı</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yüzme kesesi</td>
			<td>Yüzme kesesinin varlığı, yokluğu veya kısmi gelişimi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pigmentasyon</td>
			<td>Aynı yaştaki tedavi edilmemiş balıklara kıyasla daha az veya hiç melanosit yok</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nekroz</td>
			<td>Vücudun herhangi bir yerinde nekroz varlığı (hafif veya şiddetli) veya nekroz olmaması</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gecikmiş geliştirme</td>
			<td>Aynı yaştaki vahşi tip kontrollere kıyasla gecikmiş gelişme veya durdu.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dokunma tepkisi</td>
			<td>Bir irkilme sonrasında gecikmiş veya hiç yanıt yok (örneğin, pipet ucu kullanarak)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kesilme</td>
			<td>Arka zebra balığı gövdesinin olmaması (yani kuyruğun oluşumu)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yüzgeç -leri</td>
			<td>İnce yumurta sarısı uzantısının eşlik edebileceği kuyruk yüzgecinin varlığı veya yokluğu</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Küçültülmüş gövde ekseni</td>
			<td>Normal görünen ancak ölçüldüğünde balıkların uzunluğu daha kısadır</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: İlaç maruziyeti çalışmalarının ardından gözlemlenebilecek görsel morfolojik kusurların bir listesi.
Ek Tablo S1: Bosutinib için 4 dpf'de (maruziyetten 1 gün sonra) temsili morfolojik sonuçlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67759/SupplementalTable_1.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Erken Evre Zebra Balığı Larvalarında Küçük Molekül Taraması ve Toksisite Testi

Zebrafish have become a prominent model organism for human translational research, toxicity testing of small molecules and environmental pollutants, ...

small-molecule-screening-toxicity-testing-early-stage-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Zebra balığı güçlü olarak ortaya...

Büyük Ölçekli Zebra balığı Tabanlı In vivo Küçük Molekül Ekran

Burada immün-modülatör biyoaktif bileflikler tanımlanmasını amaçlayan bir roman yüksek içeriği kimyasal yolla oluşan inflamasyon testi açıklar. Biz başarıyla inflamatuvar yanıt olarak daha fazla veri işleme, analiz, madencilik ve depolama otomatik ölçümü sağlayan özel geliştirilmiş yazılım komut ile otomatik mikroskopi birleştirdik.

Kolaylaştırılması İlaç Keşfi: Zebra balığı An Otomatik Yüksek içeriği Enflamasyon Assay

Bu makalede, zebra balığı embriyoları kimyasal toksisite taraması için kullanılmıştır. Kimyasal toksisite, fenotip okumaları ile ilişkilidir. Numune protokolü, kimyasal toksisite taramasının gerçekleştirilmesine yönelik metodolojik bir yaklaşımı göstermektedir.

Embriyo Bazlı Kimyasal Toksisite Ekranı: Zebra Balığı Embriyolarının Geliştirilmesi Üzerindeki Etkilerin Değerlendirilmesi

Bu makale, zebra balıklarının larva hareketini izleyerek toksik bileşiklere karşı davranışsal tepkisini açıklamaktadır. Protokol ayrıca zebra balığı larvalarının çevresel kirleticiye verdiği tepkinin bir örneğine de bakıyor.

Larva Hareket Deneyi: Zebra Balığı Larvalarında Bir Bileşiğin Nörodavranışsal Toksisitesini İncelemek İçin Yüksek Verimli Yöntem

Zebra balığı omurgalı gelişimsel süreçleri ve model insan hastalığı araştırmak için mükemmel bir deneysel organizmadır. Burada, bir ile zebra balığı embriyolarının bir manuel yüksek verimli kimyasal ekran gerçekleştirmek için nasıl bir protokol tarif Okuması in situ hibridizasyon (VVISH) içinde tüm montaj.

Zebra balığı Embriyolar kullanılarak Yüksek verim Yaklaşıyor A Manuel Küçük Molekül Ekran

Zebra balığı embriyoları kimyasal bileşiklerin toksisitesini değerlendirmek için kullanılır. Onlar harici geliştirmek ve kimyasallara duyarlı, ince phenotik değişikliklerin tespitine izin. Deney sadece doğrudan embriyo içeren plaka eklenir bileşik küçük bir miktar gerektirir, test sistemi verimli ve maliyet-etkin hale.

Zebrabalığı Embriyoları Kullanılarak Kimyasal Bileşiklerin Toksisitesinin Hızlı Değerlendirilmesi

Bu makalede zebrabalığı larvaları modeli kullanılarak çevresel kirleticilerin nörodavranışsal toksisitesinin değerlendirilmesi için ayrıntılı bir deneysel protokol sunulmuştur, buna maruz kalma süreci ve nörodavranışsal göstergeler için testler de dahildir.

Çevresel Kirleticilerin Zebrabalığı Larvaları Üzerindeki Nörodavranışsal Etkilerinin İncelenmi

Zebrabalığı ksenogreft modelleri, in vivo mikroortamda yüksek üretimli ilaç taraması ve insan kanser hücrelerinin floresan görüntülemesini sağlar. Zebra balığında hasta kaynaklı lösemi örnekleri üzerinde otomatik floresan mikroskop donanımlı görüntüleme ünitesi kullanılarak büyük ölçekli, otomatik ilaç taraması için bir iş akışı geliştirdik.

Zebrabalığında Primer Hasta Kaynaklı Tümör Xenograftların İlaç Taraması

Zebra balığı son zamanlarda potansiyel radyasyon değiştiricilerini doğrulamak için bir model olarak kullanılmıştır. Mevcut protokol, radyasyona dayalı tarama deneyleri için zebra balığı embriyolarını kullanmanın ayrıntılı adımlarını ve farklı tedavilerin ve radyasyonun etkisini değerlendirmek için bazı gözlemsel yaklaşımları açıklamaktadır.

Potansiyel Radyosensitizörleri veya Koruyucuları Değerlendirmek için Bir Model Olarak Zebra Balığı Larvaları

Zebra balığı embriyo titreşimi ürkütücü tepkisine dayalı olarak kimyasal bileşik toksisitesini değerlendirmek için bir tarama sisteminin iş akışını ve veri analizini açıklıyoruz. Sistem, zebra balığı embriyolarının bir titreşim uyaranına maruz kaldıklarında hareketlerini kaydeder ve genel toksisite/ölümcüllük ve nöromüsküler toksisitenin entegre bir değerlendirmesine izin verir.

Zebra Balığı Titreşim İrkilme Tepkisi Tarama Sistemi Kullanılarak Kimyasalların Toksisitesinin Değerlendirilmesi

Keşfedin küçük molekül taraması ve toksisite testi yöntemini Danio rerio larvalarında morfolojik değerlendirme için. Bu protokol ilaç etkilerini ve gelişimsel toksisiteyi analiz etmeye yardımcı olur.

Erken Evre Zebra Balığı Larvalarında Küçük Molekül Taraması ve Toksisite Testi

Daha fazla video keşfet