Kronik yara yönetimi için çekirdek kılıflı 3D biyobaskılı iskele kullanarak hücre dışı vezikül dağıtımını optimize etme

Araştırma kapsamı, etkili kronik yara yönetimi için gelişmiş bir biyoaktif yara örtüsü tasarımı geliştirmektir. İskele, hücre dışı veziküllerin kontrolünü, bozulmasını ve verimli yerel dağıtımını sağlayacaktır.

Mevcut protokol, kronik inflamasyonun tedavisinde geleneksel yara örtüsünün sınırlamasının üstesinden gelmeyi amaçlamaktadır. Özellikle, kontrol eksikliği, bozulma ve zamanında hücre dışı vezikül salınımı.

Bu protokol, çeşitli uygulamalar için genler de dahil olmak üzere terapötik ajanları zamanında iletmek için Ayarlanabilir bir yaklaşım sunar.

Tüm sonuçlar, çeşitli yara tipleri için bir iskelenin özelleştirilmesi ve hücre dışı veziküllerin belirli bir biyoaktif molekül ile yüklenmesi yoluyla rejeneratif tedavilerin geliştirilmesi konusunda yeni bilgiler sağlar.

Laboratuvarımız, diyabetik yara iyileşmesini ele almak için translasyonel bir araştırma platformu oluşturacak.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, 37 santigrat derece su banyosunda bir mezenkimal kök hücre şişesini hızla çözün. Küçük bir buz parçası kaldığında şişeyi çıkarın. Mezenkimal kök hücre şişesinin tüm içeriğini, tam ortam içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 200 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini bir mililitre ön ısıtma tam ortamında yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri dört mililitre tam ortam içeren bir T25 şişesine aktarın. Hücrelerin eşit şekilde dağıldığından emin olmak için T25 şişesini hafifçe eğin. Şişeyi% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. Hücreler %70 ila %80 birleşmeye ulaştığında, harcanan ortamı T25 şişesinden aspire edin. Kalan hücreleri çıkarmak için şişeye üç mililitre taze PBS ekleyin. Daha sonra, şişeye bir mililitre% 0.25 tripsin çözeltisi ekleyin ve inkübe edin. Mikroskop altında 4x büyütmede hücre ayrılmasını izleyin. Şimdi şişeye dört mililitre ön ısıtma, tam ortam ekleyin ve bir ayırma işlemine kadar yüzey üzerinde yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir santrifüj ikisine aktarın. Santrifüjlemeden sonra, hücre peletini taze, tam ortamda yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. Daha sonra hücreleri, santimetre kare başına 5.000 hücre tohumlama yoğunluğuna sahip bir T75 şişesine aktarın. T75 şişesini 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile inkübe edin. 72 saat sonra, hücre dışı vezikül izolasyonu için şartlandırılmış ortamı hücrelerden toplayın. Hücre dışı vezikülleri veya EV'leri izole etmek için, hücresel kalıntıları gidermek için toplanan 13 mililitre şartlandırılmış ortamı 800 G'de 15 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı filtrelemek ve büyük parçacıkları çıkarmak için 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresi kullanın. Şimdi filtrelenmiş şartlandırılmış ortama beş mililitre yağış tamponu ekleyin. Homojen olmasını sağlamak için karışımı iyice vorteksleyin. Hücre dışı veziküllerin çökelmesine izin vermek için karışımı gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra karışımı 3.220 G'de 20 santigrat derecede 30 dakika santrifüjleyin. Tüplerin dengeli olduğundan emin olun. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice atın ve beş saniye boyunca tekrar santrifüjleyin. Şimdi, veziküllere zarar vermemek için EV peletini 200 mikrolitre PBS'de nazikçe yeniden askıya alır. CD63, CD81 ve CD9 dahil olmak üzere hücre dışı vezikül spesifik belirteçleri tespit etmek için western blotlama yapın. Steril ultra saf suda taze% 4.5 sodyum aljinat çözeltisi hazırlayın. Tam çözünmeyi sağlamak için çözeltiyi gece boyunca 60 santigrat derecede karıştırın. Daha sonra,% 3.8'lik bir çözelti elde etmek için Karboksimetilselülozu steril ultra saf suda çözün. Hazırlanan biyo mürekkepleri 3.220 G'de 25 santigrat derecede 10 dakika santrifüj ederek baskı işlemine müdahale edebilecek kabarcıkları çıkarın. Şimdi bir şırınga karıştırıcı kullanın ve hazırlanan sodyum aljinat çözeltisinin üç mililitresini etiketli EV'ler veya Diyalimmi kontrolü ile karıştırın. Düzgün bir süspansiyon sağlamak için yavaşça iyice karıştırın. Mililitre başına 0,5 mili birimlik bir nihai konsantrasyon elde etmek için bir mililitre Karboksimetilselülozu steril ultra saf suda taze hazırlanmış aljinat Liyaz çözeltisi ile birleştirmek için başka bir şırınga karıştırıcısı kullanın. Sodyum aljinat EV biyo mürekkebini aynı anda çekirdek kısma ve Karboksimetilselüloz aljinat Liyaz biyomürekkebini şırınga kurulumunun kılıf kısmına yükleyin. 3D biyo yazıcı yazılımını başlatın. İskele yapısını oluşturmak için çapraz dolgu desenine sahip silindirik bir şekil seçin. Silindir çapını 20 milimetreye ve yüksekliği 1,1 milimetreye ayarlayın. Gözenek boyutunu bir milimetre olarak yapılandırın. Çekirdek ve kılıf nozulu pompalama hızlarını, katman başına 0,25 milimetre kalınlıkla saniyede bir milimetreye ayarlayın. Hareket hızını saniyede altı milimetre olarak ayarlayın ve oda sıcaklığında dört katman yazdırın. Ekstrüzyon işlemi sırasında iskeleyi çapraz bağlamak için aerosol kalsiyum klorür içeren bir nemlendirici kullanın. İskeleyi polyester film üzerine yazdırmaya başlayın. Etkili çapraz bağlantı sağlamak için nemlendirici memesini ekstrüzyon kafasından yaklaşık 20 santimetre uzağa yerleştirin. Çapraz bağlamayı tamamlamak için iskeleyi 10 dakika boyunca %2,2 kalsiyum klorür çözeltisine daldırın. Fazla kalsiyum klorürü ve bağlı olmayan biyo mürekkebi çıkarmak için iskeleyi steril ultra saf suyla üç kez durulayın. Anestezi uygulanmış bir OCTA diyabetik farede sırt derisini elektrikli bir kesme makinesi ile tıraş edin, cilt tahrişini veya yaralanmasını önleyin. Şimdi her farenin sırt yüzeyinde altı milimetre dairesel tam kalınlıkta bir deri yarası oluşturun. PKH etiketli hücre dışı veziküller içeren 3D Biyobaskılı iskeleyi yara yatağına nazikçe yerleştirin. İskelenin yara yüzeyini tamamen kapladığından emin olun ve hava ceplerini en aza indirmek için steril forseps ile hafifçe bastırın. Anestezi uygulanmış fareleri implanttan iki saat, dört saat, sekiz saat ve 24 saat sonra IVIS görüntüleme sistemine aktarın. Görüntüleme sihirbazında, floresan görüntüleme seçeneğini seçin ve PKH boyası için uyarma ve emisyon filtrelerini etkinleştirin. Sinyal algılamayı optimize etmek için görüş alanı ve konu yüksekliği dahil olmak üzere kamera ayarlarını yapın. Görüntüleri almaya başlayın, elde edilen verileri kaydedin. Ardından, etiketli EV'lerden floresan sinyalleri serbest bırakın. Karboksimetilselüloz aljinat Liyaz İskelesindeki aljinat EV'ler, özellikle iki ve dört saatlik zaman noktalarında, yalnızca Karboksimetilselülozdaki aljinat EV'lere kıyasla daha hızlı bir salım profili sergiledi.