Atomik Kuvvet Mikroskobundan Türetilmiş Kuvvet Haritalarından Doğal Murin Pulmoner Bazal Membranlarının Young Modülünün Çıkarılması

Araştırmamızda, hücre dışı matriksin mekanik özelliklerinin hücre davranışı ve doku bütünlüğü üzerindeki etkisini araştırıyoruz. Hücreler ve mikro çevreleri arasındaki etkileşimin metastaz oluşumu gibi patolojik süreçleri nasıl etkilediğini anlamak istiyoruz. Pulmoner bazal membranın mekanik özelliklerini veri madenciliği yaparak, daha yumuşak bazal membranların kanser hücresi istilasına karşı daha dirençli olduğunu keşfettik.

Protokolümüzde sunulan yöntem, mekanik özelliklerini koruyan sabitlenmemiş biyolojik numunelerin kriyoseksiyonunu ve mekanik incelemesini sağlar. Ve ayrıca, protokolümüzde açıklanan bir atomik kuvvet mikroskobu ölçümü ve filtreleme prosedürleri ile yalnızca alveolar duvarın içindeki bazal zarın Young modülünü belirlemenin bir yolunu gösterir. Bir sonraki adım, bazal membran sertliğinin dinamikleri ve potansiyel olarak teşhisi iyileştirmek ve tedavi seçeneklerini yönlendirmek için gelişimsel ve patolojik süreçlerdeki rolü hakkında daha fazla bilgi edinmektir.

Başlamak için, donmuş optimum kesme sıcaklığını veya OCT'yi, bileşik gömülü fare akciğer dokularını içeren kalıbı eksi 80 santigrat derece dondurucudan çıkarın. Buzlu kenar mikroskop slaytının ortasına çift taraflı yapışkan bant yerleştirin. Sıkı ve kabarcıksız bir yapışma sağlamak için 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünü bandın üzerine yuvarlayın.

Bandın uzunluğunun, numuneyi içeren OCT bloğunun genişliğiyle eşleştiğinden emin olun. Slaytları, örnek bilgiler ve bölüm numaraları da dahil olmak üzere bir kalemle etiketleyin. Hazırlanan mikroskop slaytlarını bir slayt kutusuna yerleştirin.

Slaytları soğutmak için slayt kutusunu kriyotom odasının içine yerleştirin. Ardından, numune tutucunun iç iki halkasını OCT ortamı ile doldurun. Numuneyi, numune tutucu üzerindeki OCT ortamı içine yerleştirin.

Numune tutucuyu, OCT ortamı tamamen katılaşana ve numune sıkıca sabitlenene kadar yaklaşık 10 dakika kriyotom odasına yerleştirin. Şimdi, numune tutucuyu kriyotomun kesme aşamasına takın. Soğuk bir başparmağınızla sıkıca bastırarak numuneye bir parça tek taraflı yapışkan bant yapıştırın.

Kriyotom kullanarak 15 mikrometrelik bir doku kesiti oluşturun. Kesme işlemi sırasında bölümü yönlendirmek ve yapışkan bandın ayrılmasını önlemek için bir fırça kullanın. Çift taraflı yapışkan bantlı soğutulmuş bir mikroskop lamı kullanın ve almak için bölüme sıkıca bastırın.

Bölümü taşıyan sürgüyü tekrar slayt kutusuna yerleştirin. Konsolu termal gürültü yöntemini kullanarak kalibre etmek için, atomik kuvvet mikroskobunun veya AFM'nin s'ye sample. AFM kafasını s'ye yerleştirinample.

Ardından, konsol tutucu ile mikroskop lamı arasındaki boşluk yaklaşık bir ila iki milimetre olana kadar step motorları kullanarak AFM kafasını indirin. Uzun bir iğne ile bir mililitrelik bir şırınga kullanarak, konsol tutucunun yan tarafına PBS uygulayın, aşağı akmasına ve boşlukta sıvı bir menisküs oluşturmasına izin verin. Temas tabanlı kalibrasyon yapmak için AFM kontrol yazılımında Veri Al sayfasına gidin ve Gelişmiş Görünüm seçeneğini belirleyin.

Sağ üst köşede bulunan burger menü düğmesine tıklayarak Kalibrasyon Yöneticisine erişin. Ardından, yöntem olarak Kişi tabanlı'yı seçin ve konsol adı olarak Ad açılır menüsünden MLCT-F konsolunu seçin. Ayar Noktası alanına bir volt ve Tarama sayısı alanına 10 volt girin.

Veri Al sayfasında, sol taraftaki kontrol paneline otomatik yaklaşma prosedürü için bir voltluk bir Ayar Noktası girin. Otomatik yaklaşımı başlatmak için arayüzün sol üst köşesindeki mavi aşağıyı gösteren ok düğmesine tıklayın. Yaklaşma tamamlandığında ve konsol mikroskop lamı ile temas ettiğinde, kalibrasyonu başlatmak için Kalibrasyon Yöneticisi penceresindeki Kalibre Et düğmesine tıklayın.

Kalibrasyon tamamlandıktan sonra, Kalibrasyon Yöneticisi penceresini kapatın ve belirlenen kalibrasyon sonuçlarını içeren önceden seçilmiş dizinde bir kalibrasyon dosyasının oluşturulduğundan emin olun. Başlamak için, kesitli fare akciğer dokularını içeren numune slaytını dondurucudan alın. Mikroskop slaytını AFM'nin s s üzerindeki s'ye yerleştirin.tage.

Ayarlar Yöneticisi'ne gitmek için kullanıcı arayüzünün sağ üst köşesindeki İngiliz anahtarı simgesi olan düğmeye tıklayın. Yaklaşma Ayarları bölümünde, Hedef Yüksekliği dört mikrometre olarak ayarlayın. Ardından, Gelişmiş Geri Bildirim Ayarları altındaki Geçerli Mod Ayarları bölümünde çarpanı bire ayarlayın.

Geçerli Mod Ayarları'nın Kuvvet Ayarları alt bölümünde, Sondaki Mod açılır menüsünden Geri Çekilmiş Piezo'yu seçin. Sol taraftaki kontrol panelinde, kuvvet girinti eğrileri için parametreleri ayarlayın. NanoWizard 4 XP ve MLCT konsol F girişi için Ayar Noktası beş nanonewton'a, Z Uzunluğu sekiz mikrometreye ve Z Hızı saniyede 300 mikrometreye kadar.

Ardından, bir hava tarafından diğerine uzanan tüm alveolar duvarı kapsayacak şekilde ilk genel bakış kuvvet haritasının konumunu ve boyutunu tanımlayın. Piksel sayısını 50 x 50 olarak ayarlayın. Genel bakış haritasını kaydettikten sonra, piksel sayısını 50 x 50 eğride tutarak, bazal membran üzerinde üç x üç mikrometre veya dört x dört mikrometre boyutunda daha odaklanmış bir kuvvet haritası yakalayın.

Kuvvet girinti eğrilerini analiz etmek için MATLAB'da CANTER İşleme Araç Kutusu'nu başlatın ve Kuvvet Eğrisi Analizi uygulamasını açın. Ardından akciğer bölümünün yüksek çözünürlüklü kuvvet haritasını yüklemek için Dosya Seç'e tıklayın, kaydetme konumuna gidin, dosyaya çift tıklayın ve Verileri Yükle'yi seçin. Konsol için kalibrasyon değerlerini isteyen açılır pencere göründüğünde, kalibrasyon değerlerini ilgili düzenleme alanlarına girin.

Devam etmek için Gönder düğmesine tıklayın. İkinci bir açılır pencerede, Gönder düğmesine tıklayarak nicel görüntüleme veya QI haritasının yükleme prosedürüne devam edin. Yükleme işleminin tamamlanmasının ardından, kuvvet haritasının ilk kuvvet eğrisi ekranda görüntülenir.

İlgili düzenleme alanındaki sığma derinliğini 1,5 mikrometre olarak ayarlayın ve kişi bulucu algoritması için Hertz fit ile seçin. Değiştirilen Hertz modelinin sığdırma özelliğini QI haritasının tüm kuvvet girinti eğrilerine uygulamak için, Tümüne uygula düğmesini tıklatın. Son kuvvet eğrisi analizinin tamamlanmasından sonra, dosyaları kaydetmek için bir pencere açılır.

Evet'i tıklatın ve sonuç dosyaları için bir ad girin. CANTER Processing Toolbox'ta yer alan Application Selection (Uygulama Seçimi) penceresinden QI haritasının mekansal filtrelemesi için Result Filtering Tool'u seçiniz ve Start Application (Uygulamayı Başlat) butonuna tıklayınız. Uygun sonuçları yüklemek için, Sonuç Filtreleme Aracı kullanıcı arayüzünün üst menü çubuğundaki Aç'a tıklayın.

Sonraki açılır pencerede, JPK Haritalar sekmesi altındaki ilk Ayarla düğmesini bulun ve kuvvet eğrisi analizi sonuçlarını içeren tsv dosyasını seçin. Ardından ikinci Set düğmesine tıklayın ve seçilen tsv dosyasına karşılık gelen QI harita dosyasını bulun. Ardından, harita verilerini yüklemek ve eğri analizi sonuçlarını zorlamak için Gönder'i tıklayın.

Üst kısımdaki Görüntülenen kanal açılır menüsünden, Young'ın modül sonuçlarını bir harita görüntüsü olarak görüntülemek için EModul seçeneğini seçin. Ardından, histogram grafiğinin altındaki Veri kanalı açılır menüsünden, QI haritasının yüklenen Young modül değerlerinin dağılımını görselleştirmek için EModul seçeneğini seçin. Ardından, kullanıcı arayüzünün ortasındaki Manipülasyon akışı ok düğmesine tıklayın ve sağ tarafı gösterdiğinden emin olun.

Görüntü filtresi açma/kapatma düğmesini, histogram eksenlerinin üzerindeki Filtre panelinde Açık konumuna ayarlayın. Filtre geometrisi açılır menüsünden Freehand seçeneğini seçin ve ardından Ekle düğmesine tıklayın. Üst kanal görüntüsünde, farenin sol düğmesini basılı tutarken bazal membranı daire içine alarak filtre maskesini çizin.

Ardından işiniz bittiğinde fare düğmesini bırakın ve haritaya uygulamak için maskeye çift tıklayın. Maskelenmiş Young'ın modül değerleriyle yeni bir tsv sonuç dosyasını kaydetmek için üst menü çubuğunda Kaydet, Histogramı Kaydet ve Verileri Kaydet'e tıklayın. Görüntülenen açılır pencerede, tsv dosyasına hangi sonuçların yazılacağını seçmek için Tümünü seç'e tıklayın.

Ardından seçimi onaylamak için Tamam düğmesine tıklayın. Kaydet iletişim kutusunda tsv dosyası için bir ad girin, istediğiniz kaydetme konumunu seçin ve filtrelenmiş sonuçları kaydetmek için Tamam'ı tıklatın. Pulmoner bazal membranın Young modül değerleri, 9.31 tepe değeri ve 0.18 standart sapma ile bir log normal dağılım sergiledi ve 11.05 kilopaskallık temsili bir Young modülü verdi.

Bu bulgular ayrıca kantil-kantil grafiği ile doğrulandı.