Üç Boyutlu Folikül Kültürü için Yeni Bir Hyaluronan Hidrojelin Uygulanması ve Fare Yumurtalık Folikülü Kriyoprezervasyonu için Metodoloji

Bu araştırma, in vitro folikül büyümesi ve oosit olgunlaşması için bir 3D kültür sistemi geliştirmeye odaklanmıştır. Bir hücrenin doğal hücre dışı matrisinin bileşenlerini kullanarak böyle bir sistem oluşturmak, folikül gelişimini artıracaktır. En büyük zorluk, hayvan modellerinden elde edilen bilgileri insan folikül kültürüne uygulamaktır.

İnsan yumurtalık dokusuna erişim sınırlıdır. Ve insan folikülleri, oosit olgunlaşmasını sağlamak için kültürde önemli ölçüde daha uzun bir süreye ihtiyaç duyar. Bu çalışmada geliştirilen 3D kültür modeli, insan yumurtalık foliküllerinin kültürlenmesi için özellikle yararlı olabilir ve oosit olgunlaşması için kültürde ihtiyaç duyulan uzun süre boyunca 3D mimarinin korunmasına izin verebilir.

Başlamak için, prosedür için 10 ila 14 günlük B6D2F1 fare yavrularından yumurtalıklar alın. 6 mililitre önceden dengelenmiş folikül kültür ortamını veya FCM'yi iki adet 60 milimetrelik tabağa pipetleyin ve mineral yağ ile kaplayın ve inkübe edin. Çanağın orta kuyusuna 1 mililitre kollajenaz ve dış kuyucuğa 3 mililitre yumurtalık dokusu veya OT ortamı pipetleyin.

Yumurtalıkları kollajenaz çözeltisine taşıyın. Kollajenaz inkübasyonunun sonunda, kollajenaz ile tedavi edilmiş yumurtalıkları durulamak için dış kuyuya taşıyın. Mikropipetleri değiştirin ve yumurtalıkları OT ortamıyla dolu taze bir tabağa aktarın.

Folikülleri toplamak için, enzimle tedavi edilmiş yumurtalık dokusunu farklı boyutlarda kesilmiş pipet uçlarından tekrar tekrar aspire edin ve dışarı atın. Sekiz folikül salınımına kadar 27 gauge iğne kullanarak dokuyu mekanik olarak kızdırın. 40x büyütmede diseksiyon mikroskobu altında inceleyin ve sağlam bir bazal membran içine alınmış merkezi olarak yerleştirilmiş bir oosit ile ikincil preantral folikülleri taze bir OT kabına alın.

Gömme işlemine başlamadan önce FCM2 kabını 60 dakika inkübatöre yerleştirin. Durulama için kapakta hidrojen peroksit içermeyen iki adet 25 mikrolitre HA jeli damlatın. Kültür ortamından arındırmak için gömülecek folikülleri veya folikül kümelerini FCM kabından bir damla hyaluronan veya HA jeline taşıyın.

FCM çanağını gaz vermek için fıskiyenin altına geri yerleştirin. Folikülleri gömmek için, 60 milimetrelik bir kabın kapağına 1 mikrolitre %0,03 hidrojen peroksit damlası koyun. Şimdi, mililitre HA jeli başına 25 mikrolitre 3 miligram ekleyin ve karıştırın.

Yaklaşık sekiz ila 10 mikrolitre HA hidrojen peroksit karışımını sekiz oyuklu kültür kabının iki ayrı kuyucuğuna pipetleyin. Ve folikülleri, folikül kümelerini veya yumurtalık dokusu parçalarını her damlanın merkezine hızla aktarın. Damlanın içinde kabarcık olmadığından emin olun.

Üç dakika sonra, her bir oyuğa 100 mikrolitre önceden dengelenmiş folikül kültürü ortamı ekleyin. Ilık, önceden dengelenmiş mineral yağ ile kaplayın ve yemeği inkübe edin. Vitrifikasyon işlemi için gerekli ekipman ve solüsyonları hazırlayın.

RI taşıyıcısını sıvı nitrojen içeren kriyo kutusundaki yuvaya yerleştirin. İki damla önceden ısıtılmış vitrifikasyon solüsyonu 1 veya VS1'i 60 milimetrelik bir kabın üst kısmına yakın bir kap kapağına yan yana yerleştirin. Şimdi, ilk damlaya iki folikül yerleştirin, durulayın ve beş dakikalık bir inkübasyon için hızla ikinci VS1 damlasına taşıyın.

Foliküller inkübe ederken, VS1 damlalarının hemen altına üç VS2 damlası yapın. Ardından folikülleri 60 saniye içinde üç VS2 damlası boyunca sırayla hızla hareket ettirin. Vitrifikasyon için folikülleri VS2'den alın.

Parçalara ayırma kapsamı altındaki RI taşıyıcısını görüntüleyin. Ve plastik çubuktaki küçük deliği görselleştirmek için odağı ayarlayın. Folikülleri minimum sıvı ile deliğe bırakın.

Plastik çubuğu önceden soğutulmuş dış pipete bırakın. Ve pipeti kapatmak için ultrasonik bir kapatıcı kullanın. Pipeti, kriyo kamışına bağlı bir kadehin içine yerleştirin.

Bastonu plastik bir koruyucu kılıfla örtün ve sıvı nitrojene daldırın. Açık taşıyıcı vitrifikasyonu için, metal CL sapını mıknatıslanmış flakon kapağına yerleştirerek taşıyıcıyı hazırlayın ve sağlam bir tutuş sağlayın. Kriyo şişelerini tutmak için kriyo kutusuna bir raf yerleştirin ve sıvı nitrojenin şişelerin üst kısmının altında olduğundan emin olun.

Mıknatıslanmış icat edilmiş bir kriyo şişesini sıvı nitrojenle doldurun ve rafa yerleştirin. CL açık taşıyıcıyı manyetik bir çubuk kullanarak takılı manyetik kapağından kavrayın. Kriyoprotektan bir film oluşturmak için CL taşıyıcısını ayrı bir VS2 damlasına batırın.

Tüm folikülleri veya folikül kümelerini toplayın ve minimum sıvı ile filmin üzerine yerleştirin. Numuneyi vitifikasyona uğratmak için CL'yi hemen sıvı nitrojenle dolu kriyo şişesine daldırın. Kriyo şişesini kriyo bastonunun üzerine yerleştirin ve ardından plastik bir kılıfla örtün.

Bastonu sıvı nitrojen depolama tankına daldırın. Dış kuyuda 3 mililitre önceden dengelenmiş FCM ve orta kuyuda 1 mililitre içeren bir orta kuyu kabı hazırlayın. Ortamı yağ ile kapladıktan sonra, tabağı gaza getirmek için fıskiyenin altına yerleştirin.

37 santigrat dereceye kadar önceden dengelenmiş 0,5 mililitre ısıtma solüsyonu WS1 ve WS2'yi iki etiketli orta kuyucuklu tabağa yerleştirin. Kriyo bastonlarını numunelerle birlikte depolama tankından sıvı nitrojenle dolu bir kriyo kutusuna taşıyın. İlk önce plastik baston kapağını çıkarın.

Ardından pipeti daldırarak kadehten çıkarın ve kriyo kutusundaki tutma yuvasına kaydırın. Dış pipeti siyah noktanın hemen üzerinden kesin. İç plastik çubuğu dış pipetten kaldırın ve çubuğu hızla WS1'e daldırın, folikülleri 10 saniye içinde boşaltmak için hafifçe döndürün.

WS1'de iki dakika sonra, üç dakikalık bir inkübasyon için folikülleri veya folikül kümelerini WS2'ye aktarmak için bir mikro pipet kullanın. Daha sonra bunları bir FCM kabına aktarın ve folikülleri yerleştirmeden önce merkezde bir ila iki saat inkübe edin, Açık taşıyıcı CL ısıtması için FCM ve WS kabı hazırlığını tekrarlayın. Kriyo kamışı bir kriyo kutusuna aktarın ve plastik baston kapağını çıkarın.

CL'nin metal gövdesi görünene kadar kriyo flakon kapağını kaldırmak için manyetik bir çubuk kullanın. Manyetik çubuğu kullanarak kapağı takılı CL taşıyıcıyla kavrayın. Ve CL'yi hızlı bir şekilde WS1'e daldırın ve folikülleri 10 saniye içinde boşaltmak için döndürün.

Preantral folikül büyümesi, üç boyutlu hyaluronan jel kültüründe korundu ve 12. günde görülebilen bir antrum ile doğal folikül mimarisi korundu. Hyaluronan jel içindeki kapsüllenmiş foliküller, granüloz hücre proliferasyonu nedeniyle radyal genişleme sergiledi ve folikül çapları kültür periyodu boyunca yaklaşık 139.8 mikrometreden 385.6 mikrometreye yükseldi. İnsan koryonik gonadotropin tetiklemesinden sonra folikülün yakınında yumurtlanmış metafaz iki oosit bulundu.

Oositlerin çapı yaklaşık 84.8 mikrometre olarak ölçüldü. Taze yumurtalıklarla, hem bireysel foliküller hem de folikül kümeleri iyi olgunlaşma oranları sergiledi. Dondurularak saklanan yumurtalıklardan alınan folikül kümeleri, erken oosit ekstrüzyonuna yol açan daha düşük olgunlaşma oranları sergiledi.

İzole folikül kriyoprezervasyonu, tüm yumurtalık korumasından daha etkiliydi. Her iki taşıyıcıda da folikül vitrifikasyonu, soğutma hızı farklılıklarından bağımsız olarak yüksek olgunlaşma oranlarına ulaştı. CL açık taşıyıcı sistemi, birden fazla folikülün etkili bir şekilde kriyo-korunmasına olanak tanıyarak işlem süresini kısalttı.