Gelişmiş beyin floresan boyaması ve immün boyama için Drosophila kafalarının doğrudan kriyoseksiyonu

Ekibimiz Drosophila modelini kullanarak metabolik, kardiyak, kas uykusu ve yaşlanma bozukluğu üzerine çalışmaktadır. Bu Jove makalesi, dekapitasyon, fiksasyon, kriyoseksiyon, boyama ve görüntüleme dahil olmak üzere beyin dokusu işleme için basitleştirilmiş protokolü ayrıntılı olarak açıkladı. Araştırma grubum, çeşitli insan hastalıklarını ve yaşlanmasını incelemek için Drosophila modelinin geliştirilmesine öncülük etti.

Ayrıca zaman kısıtlı beslenme ve egzersiz gibi müdahaleleri de araştırdık. Hücresel bütünlük, fizyoloji ve davranış üzerindeki etkilerini ortaya çıkarmak için sirkadiyen ritim ve genetik gibi faktörleri incelemek için makine öğrenimi, omik ve moleküler yaklaşım kullanıyoruz. Bu basitleştirilmiş Drosophila beyin araştırma protokolü, karmaşık diseksiyonları önler, yalnızca tek elle yürütme gerektirir ve maliyetli konfokal mikroskopi ihtiyacını ortadan kaldırarak erişilebilirliği artırır ve ekipman bağımlılığını azaltır.

Başlamak için, sinekleri yaşlanan şişelerde elde edin, ardından karbondioksit matı üzerindeki valfi açın ve kaçmayı önlemek için sinekleri hızla matın üzerine boşaltın. Sinekler çoğunlukla bilinçsiz hale geldiğinde, matı objektif merceğin altına hareket ettirerek sinekleri SZ61 mikroskobunun altına yerleştirin. Büyütmeyi ayarlayın ve sinekler net bir şekilde görünene ve kafalarını kesmek için rahat olana kadar odaklanın.

Yaylı makas kullanarak, bıçakları göğüs kafesi ile sineğin başı arasına yerleştirin ve deney grubu başına beş ila 10 sinek kafasının başını kesmek için sıkıca sıkın. Herhangi bir ve kullanılmış sinekleri yaşlanan şişelerine geri koyun. Bir fırça kullanarak, kafası kesilmiş sinek kafalarını buz üzerine yerleştirilmiş etiketli 1,5 mililitrelik tüplere nazikçe aktarın.

Tüpleri buzdan çıkardıktan sonra, her tüpe 100 mikrolitre% 4 paraformaldehit ve PBS pipetleyin ve tüm sinek kafalarının tamamen suya daldırıldığından emin olun. Kafalar tüp duvarlarına yapışırsa, çözelti ile uygun teması sağlamak için bir fırça kullanarak hafifçe aşağı doğru itin veya tüpü yatay bir yüzeye hafifçe vurun. Daha sonra tüpleri orta ayarda bir orbital çalkalayıcı üzerinde 15 dakika inkübe edin.

Paraformaldehit çözeltisini atın ve PBS ile değiştirin, tüm sinek kafalarının suya daldırıldığından emin olun. Son yıkamadan sonra, sinek kafalarını PBS'de% 10'luk bir sükroz çözeltisine aktarın ve tüpün içine daldırıldıklarından emin olun. Etiketli bir kalıbı, optimum kesme sıcaklığı veya OCT bileşiği ile yaklaşık% 50 kapasiteye kadar doldurun ve kalıbın dört köşesine de yayılmasını sağlayın.

Bir fırça kullanarak, toplanan sabit sinek kafalarını kalıbın içindeki OCT bileşiğinin yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Forsepsin ucunu kullanarak, her bir kafayı yavaşça kalıbın altına doğru itin ve gözlerin koronal düzlemden bir kesim için aşağı doğru yönlendirildiğinden emin olun. Tüm bölümlerin tüm deney gruplarını aynı anda içermesini sağlamak için X, Y ve Z boyutlarındaki tüm başlıkları dikkatlice hizalayın.

Kafaları düzgün bir şekilde hizaladıktan sonra, kalıpları dondurmak için doğrudan eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir dondurucuya dikkatlice yerleştirin. Kalıp çoğunlukla donduktan sonra, kalan alanı OCT bileşiği ile doldurun. Kalıp kriyoseksiyonu için, ayna ucunu kalıba takmak için kalıbın üstüne bol miktarda OCT bileşiği uygulayın.

Ucu üstüne düz bir şekilde yerleştirin ve kriyostatın içinde tamamen donmasına izin verin, bu genellikle beş dakika sürer. Ardından ucu ve OCT bloğunu kalıptan çıkarın. Bloğu aynaya yerleştirin, uygun yukarıdan aşağıya yönün korunduğundan emin olun ve blok güvenli bir şekilde yerine oturana kadar ayna anahtarını sıkın.

Ayar düğmelerini ve ayna derinliği kontrollerini kullanarak bloğu bıçakla hizalayın. Kriyostat üzerindeki kesit genişliğini 20 mikrometreye ayarlayın ve rulo önleyici camın her dilimi yakalamasına izin verirken yavaş ve tutarlı bir hareket kullanarak her dilimi kesin. Ardından, slaytı bölümün daha yakın kenarına dokundurarak ve bölümün slaytın üzerine yükselmesine izin vererek sıcak slaytları kullanarak bölümleri yakalayın.

Slaytların oda sıcaklığında en az 30 dakika, ancak bir saatten fazla kurumasına izin verin. Kriyoseksiyonel Drosophila sinek kafalarını alın ve sürgünün kenarlarında kalan OCT bileşiğini çıkarmak için bir tıraş bıçağı kullanın ve hidrofobik bir sınır için boşluk bırakın. Ardından, her slaydın etrafına bir kenarlık çizmek için hidrofobik bir işaretleyici kullanın ve beş dakika kurumasını bekleyin.

Tüm slaytları, slaytı hafifçe pipetleyerek PBS kullanarak her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Slaytları yıkadıktan sonra, Tris Tamponlu Salin bloke edici solüsyonda %3 BSA'yı slaytların üzerine pipetleyin ve 30 dakika ila bir saat arasında inkübe edin. Daha sonra bloke edici solüsyonu atın ve birincil antikor solüsyonunu slaytlara pipetleyin.

Kurumayı önlemek için antikoru gece boyunca dört santigrat derecede veya oda sıcaklığında bir saat boyunca ıslak mendil mendilleri kullanarak inkübe edin. Birincil antikor çözeltisini atın ve slaytları PBS kullanarak her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Daha sonra ikincil antikor çözeltisini slaytlara ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Slaytları PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, slayt üzerinde sadece az miktarda PBS bırakın. Ardından, 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, slayt boyunca eşit şekilde DAPI içeren üç ila beş damla sertleştirici montaj ortamı ekleyin. Yerleştirme sırasında hava kabarcığı oluşmadığından emin olmak için sürgünün üzerine bir kapak sürgüsü yerleştirin.

Yeni monte edilmiş kızakları dikkatli bir şekilde tutun ve montaj ortamı tamamen kuruyana kadar düz bir şekilde saklayın. Uzun süreli saklama gerekiyorsa, slaytların kenarlarını kapatın. Floresan bozulmasını en aza indirmek için slaytların görüntülerini mümkün olan en kısa sürede yakalayın.

Görüntü alımı sırasında, tüm deney gruplarında tutarlılık sağlamak için aynı kanaldaki her bir benzersiz konuya odaklanın. Seçilen tüm kanallarda aşırı pozlamayı önlemek için her kanal için pozlamaları kalibre edin. Seçilen maruziyetlerin sabit kaldığından ve özellikle farklı deney grupları arasında tüm denekler için uygun olduğundan emin olun.

ApoE antikor etiketinin ekspresyonu, Elav + ve Elav-ApoE4 örneklerinin beyin bölgelerinde açıkça lokalize edildi. Lipid birikimi, her iki genotipte de beyin bölgelerinde görülebilen Nil kırmızısı boyanması ile gösterildi.