Biyomoleküllerde Yerel Esnekliği Karakterize Etmek için Tek Moleküllerden Zamanla Çözülen Floresan Anizotropisi

Bu araştırma, konfokal mikroskopi modunda zamana bağlı floresan anizotropi kullanarak biyomoleküllerin yerel esnekliğini ve dinamiklerini tek molekül düzeyinde incelemeyi amaçlamaktadır. Tek molekül tespiti ve lokalizasyonu, biyomoleküllerin gözlemlenmesini sağlamıştır, ancak dinamiklerini yakalamak başka yaklaşımlar gerektirir. Zamanla çözülen floresan yöntemleri bu boşluğu doldurmaya yardımcı olur.

Tek molekül perdesi ve NMR dahil olmak üzere biyomoleküler dinamikleri deneysel olarak incelemek için yaygın araçlar. Tek molekül düzeyinde, çeşitli analizler, süreçler, foton ile foton floresan emisyonu, bunlar arasında zaman çözümlü analiz ve patlama varyans analizi yer almaktadır.

smFRET deneyleri için birden fazla florofor kullanmak, deneysel tasarımda ve yeterince iyi kalitede numuneler yapmada karmaşıklıklara neden olabilir. Tek bir etiket ve floresan anizotropisi kullanmak bu karmaşıklıkların bazılarını çözer.

İnsan FoxP1'in çatal başlı alanının monomerik formunun düzensiz bir protein gibi davrandığını ve dimerize olduğunda katlanma popülasyonunu artırdığını bulduk.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, hazırlanan standart tampon çözeltisini 0.22 mikrometre gözenek boyutunda bir filtreden süzün. Ardından, tek molekül alımı için standart tamponu bir kömür filtresinden süzün. Floresan problar için, hazırlanan BODIPY Floresan Pro'nun küçük hacimli alikotlarını hazırlayın. Polarizasyon çözümlü kurulumun kalibrasyonu için önce paralel ve dikey dedektör kanallarını açın ve mavi lazeri açın. Lazer gücünün 60 mikrowatt'a ayarlandığından emin olun ve zamanla ilişkili tek foton sayma veya TCSPC yazılım kontrol panelini açın. Daha sonra bir mikrolitre 100 nanomolar Rhodamine 110'u 49 mikrolitre damıtılmış su ile karıştırın. Mikroskop objektif merceğinin üzerine bir damla daldırma sıvısı ekleyin. Kapak camını mikroskop objektifine yerleştirin ve su damlacığının lens üzerinde ortalandığından emin olun. Kalibrasyon ölçümleri için kapak camının ortasına 50 mikrolitre seyreltilmiş Rhodamine 110 çözeltisi ekleyin. Görüntü düzlemini çözeltinin içinde ve cam yüzeyin üzerinde olacak şekilde ayarlayın. Odak düğmesini kullanarak ikinci parlak odak noktasını bulun ve 1 1/2 tura ayarlayın. Şimdi yazılımı Zaman Etiketli Zaman Çözümlü modunda açın ve BAŞLAT düğmesine tıklayın. Sayım hızını 120 saniye boyunca kaydedin. Arka plan ölçümleri için, kapak camının ortasına 50 mikrolitre damıtılmış su ekleyin ve alımı tekrarlayın. Foton sayım oranını 300 saniye boyunca kaydedin ve dosyayı water.ptu olarak kaydedin. Ek arka plan ölçümleri için, kapak camının ortasına 50 mikrolitre standart tampon ekleyin. Foton sayım oranını 300 saniye boyunca kaydedin ve dosyayı standard_buffer.ptu olarak kaydedin. Şimdi Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL, analiz yazılımını başlatın ve otomatik pencereden Kurulumu onaylayın'a tıklayın. Ardından, Parametreleri Dosyadan Al'ı ve ardından Tamam'ı tıklayın. Analiz edilecek ölçümü seçmek için Veri Yolu Dizisi'ne tıklayın ve uygun veri kümesini seçin. Şimdi Green Scatter gibi diziler için su ölçümü water.ptu dosyasını, Yeşil arka plan için standard_buffer.ptu dosyasını ve Yeşil kalın için Rhodamine110.ptu dosyasını yükleyin. Tek Molekül seçim parametreleri altında, Yeni bir açılır pencere açmak için İleri'ye ve ardından Ayarla'ya tıklayın. Ardından, fotonlar arası varış zamanını değiştirmek için Eşik'e basın ve ortalama fotonlar arası varış zamanı için tek molekül olay zamanını seçin. Şimdi tek molekül olayı başına minimum foton sayısını ayarlamak için minimum sayıya tıklayın. Ardından Return ve OK'a tıklayarak açılır pencereyi kapatın. Floresan bozunma parametrelerini kullanarak yeşil ve diğer renkler için ilk floresan ömrünü ayarlamak için Color Fit parametrelerine tıklayın. Başlangıç ve bitiş değerlerini ayarlayarak değerleri değiştirin, isteyin ve geciktirin ve açılır pencereyi kapatın. Son olarak, ASCII dosyalarını işlemek ve seçilen klasöre kaydetmek için Kaydet'e basın. Escherichia coli C41'in bir gece ön aşılamasını 1:500 seyreltme oranında önceden eklenmiş antibiyotik ile 500 mililitre LB ortamına aktarın. Kültür büyümesini izlemek için kültürün emilimini 600 nanometrede ölçün. Optik yoğunluk 0,5 ile 0,7 arasına ulaştığında, protein ekspresyonunu indüklemek için 0,5 milimolar nihai konsantrasyona IPTG ekleyin ve inkübe edin. Bakteri hücrelerini, kültür 1.4 ila 1.6 optik yoğunluğa ulaştığında dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 3.000 g'da santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, peleti kullanana kadar eksi 20 santigrat derecede saklayın. Daha sonra, DTT veya TCEP'nin on kat fazla molarına 50 ila 100 mikromolar FoxP1 proteini ekleyin ve inkübe edin. Tampon değişimi için bir sütun adaptörü kullanarak bir PD-10 tuz giderme sütununu 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne yerleştirin. Dengeleme için kolona beş mililitre PBS tamponu ekleyin ve iki dakika boyunca 1.000 g'da santrifüjleyin. PD-10 kolonunu 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın ve kolona iki mililitre PBS tamponu ekleyin. Şimdi sütuna 500 mikrolitre FoxP1 proteini yükleyin. Saflaştırılmış proteini toplamak için iki dakika boyunca 1.000 g'da santrifüj ederek sütunu elute edin. Proteini 10 kilodalton moleküler ağırlık kesme ultra santrifüj filtreye aktarın. 7.500 g'da 10 dakika santrifüjledikten sonra konsantre elüatı toplayın. Protein konsantrasyonunu ölçün. Daha sonra BODIPY'yi ekleyin ve bir döndürücü üzerinde iki saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Tampon değişimini ve protein konsantrasyonunu tekrarlayın. Protein konsantrasyonunu belirledikten sonra, formülü kullanarak etiketleme derecesini ölçün. 495 mikrolitre ultra saf su ve beş mikrolitre Tween 20'yi bir hazneli kaydırağın kuyusuna ekleyin ve iyice karıştırın. Oda sıcaklığında 30 dakikalık bir inkübasyondan sonra, hazneyi iki kez ultra saf suyla nazikçe yıkayın ve kurulayın. Arka plan floresansını düzeltmek için, bir tampon çözeltisinin ölçümlerini yapın. Hızlı dönen bir boyadan veri alarak paralel ve dik dedektörlerin bağıl hassasiyetini kalibre edin Monomerik FoxP1 üzerinde tek moleküllü floresan anizotropi deneyleri için, 100 pikomolar BODIPY etiketli FoxP1 ve 100 nano molar etiketsiz FoxP1'e 500 mikrolitre standart tampon ekleyin. Ölçümlere başlayın ve BIFL yazılımında 30 saniye içinde kaydedilen patlama sayısının 60 ile 90 arasında olup olmadığını kontrol edin. Numune daha konsantre ise, patlama sayısı bu aralığa düşene kadar seyreltin. Son olarak, ölçümleri analiz edin. Tek moleküllü floresan anizotropi ömrü analizi, FoxP1 DNA bağlanma alanındaki iki farklı rotasyonel korelasyon süresinden kaynaklanan tek bir dağılımı ortaya çıkardı ve bu da düzenli ve düzensiz yapısal toplulukların bir arada bulunduğunu düşündürdü. Patlama varyans analizi, yüksek anizotropi ve aşırı varyantlar sergileyen bir FoxP1 molekülü alt kümesini tanımladı ve bu da dinamik konformasyonel değişikliklerin varlığını düşündürdü. Foton dağılımı analizi, monomerik ve dimerik FoxP1 durumları arasında farklılaştı ve farklı anizotropi dağılımları ve döviz kurları gösterdi. Dimerizasyon, FoxP1'deki yerel ve küresel hareketleri etkiledi ve aşırı varyans ölçümleri, belirli sistein etiketli bölgelerde önemli anizotropik değişiklikleri gösterdi. Dinamik anizotropi analizi, FoxP1'in dimerizasyon ve DNA bağlanması üzerine kısmi açılmaya uğradığını, yapılandırılmış ve düzensiz popülasyonların fraksiyonunu değiştirdiğini ortaya koydu.