Name: Biyomoleküllerde Yerel Esnekliği Karakterize Etmek için Tek Moleküllerden Zamanla Çözülen Floresan Anizotropisi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Öğrenin tek molekül düzeyinde biyomoleküllerin yerel esnekliğini ve dinamiklerini zamanla çözülen floresan anizotropisi ile nasıl karakterize edilir. Bu yöntem FoxP1 proteini gibi yapıların davranışlarını incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>A20100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100</td></tr><tr><td>Amicon Ultra Santrifüj Filtre, 10 kDa MWCO</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010</td></tr><tr><td>Ampisilin sodyum tuzu</td><td>Millipore Sigma</td><td>A0166-5G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166</td></tr><tr><td>BODIP FL Maleimide (BODIPY FL N-(2-Aminoetil))Maleimid)</td><td>)ThermoFisher Scienctific</td><td>B10250</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250 Tek Kullanımlık PD 10 Tuzdan Arındırma Kolonları</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE17-0851-01</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>10197777001 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro</td><td></td></tr><tr><td>DMSO, Susuz</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>D12345</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345</td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td>10104159001 https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001</td></tr><tr><td>E. coli C41 bakteri hücreleri&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, 5 mL kolon</td><td>Bio-Rad</td><td>12004037</td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375</td></tr><tr><td>İmidazol</td><td>Millipore Sigma</td><td>288-32-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6758-1G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758</td></tr><tr><td>MCE Membran Filtre, 0.22 & mu; m Gözenek Boyutu</td><td>Millipore Sigma</td><td>GSWP02500</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Hazneli Kızak Sistemi</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534 OverExpress C41(DE3) Kimyasal Olarak Yetkili Hücreler</td><td>Millipore Sigma</td><td>CMC0017-20X40UL</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>329-98-6</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830</td></tr><tr><td>Rhodamine 110</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>419075000</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat dibazik</td><td>Millipore Sigma</td><td>7558-79-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264</td></tr><tr><td>Sodyum fosfat monobazik dihidrat</td><td>Millipore Sigma</td><td>13472-35-0</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505</td></tr><tr><td>TCEP, Hidroklorür, Reaktif Sınıfı</td><td>Millipore Sigma</td><td>580567-5GM</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>11332465001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001</td></tr></tbody></table>

biyomoleküllerde yerel esnekliği karakterize etmek için tek moleküllerden zamanla Çözülen floresan anizotropisi

Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules for Characterizing Local Flexibility in Biomolecules

Floresan anizotropisi, floroforun absorpsiyonunun nispi oryantasyonundan ve emisyon dipol momentlerinden kaynaklanır. Floroforlar polarize ışığa maruz kaldığında, gelen ışığın elektrik alan vektörü ile hizalanmış absorpsiyon geçiş momentlerine sahip floroforlar tercihen uyarılır (fotoseçim). Sonuç olarak, uyarılmış durum popülasyonu kısmen yönelimli hale gelir, uyarılmış moleküllerin önemli bir kısmı geçiş momentleri polarize heyecan verici ışığın elektrik alan vektörü ile hizalanır61. Floroforlar, Brown hareketleri nedeniyle dönerler. Böylece, emisyon geçiş momenti de döner ve floresan anizotropisine zaman bağımlılığına neden olur. Bu etki, floresan moleküllerinin dönme hareketlerini ölçmek, bağlanma olaylarını tespit etmek, floroforun ortamını karakterize etmek ve moleküler dinamikleri yakalamak için kullanılabilir.
Tek moleküllü deneyler, numunenin heterojenliğini belirlemek için benzersiz bir şekilde hazırdır. Tek molekül duyarlılığı ve floresan anizotropisinden yararlanmak, çok parametreli floresan spektroskopisine başka bir boyutluluk katar. Tipik bir tek moleküllü konfokal mikroskopta (Şekil 2)20,21, floresan anizotropisi, darbeli lazerler kullanıldığında yoğunluğa dayalı veya zamana bağlı olarak belirlenebilir.
Konfokal mikroskopta62 yüksek sayısal açıklık objektifinin depolarize edici etkilerini dikkate almak için, zamanla çözülen anizotropinin 35,63 uygun formu şu şekilde verilir:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)
burada <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq02.jpg" style="margin: auto;"> ve <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq03.jpg" style="margin: auto;"> x dalga boyunda uyarılma sonrası y'inci algılama kanalındaki zamanla çözülen floresan yoğunluğu, paralel ve dik polarizasyon l1 ve l2 için ve bu ölçümlerde kullanılan yüksek sayısal açıklık (NA) objektifi nedeniyle paralel ve dik sinyaller arasındaki karışımı tanımlayan faktörlerdir 35,62, 64. Boya için paralel, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq04.jpg" style="margin: auto;">ve dikey algılama kanalının algılama verimlerindeki farklılıklar, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq05.jpg" style="margin: auto;">algılama verimliliklerinin <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq06.jpg" style="margin: auto;">oranı ile düzeltilir. GUV aynı zamanda G faktörü olarak da adlandırılır.
Zamanla çözülen floresan anizotropisi, floroforun daha büyük bir biyomoleküle bağlanmasını açıklamak için çok üstel bir bozunma kullanılarak modellenebilir.
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq07.jpg" style="margin: auto;">,     (2)
R0, florofora bağımlı temel anizotropidir (tipik olarak R0 = 0.38), R∞ artık anizotropidir ve ρ1 ve ρ2, sırasıyla hızlı (floroforun yerel hareketleri) ve yavaş (makromolekülün küresel hareketi) dönme korelasyon süreleridir.
Tek moleküllü anizotropi ölçümlerinde (Şekil 2), patlamaya entegre floresan ömrü (BIFL) analizi33,35 kullanılarak tek tek yayıcıları tanımlamak için foton varış süreleri kaydedilir. Fotonlar arası varış süreleri (Δt), çalışan bir ortalama kullanılarak düzleştirilir ve ardından görselleştirmeye yardımcı olmak için çizilir. Bu zamanların histogramı, arka plandan kaynaklanan fotonların ortalama ve standart sapmasını belirlemek için yarım Gauss ile donatılmıştır. Standart sapmanın katları olarak ayarlanan keyfi bir eşik, her patlamadaki ilk ve son fotonları tanımlarken tek tek olayları filtrelemek için kullanılır. Her bir patlama içindeki fotonlar daha sonra, denklem 1 ve 2 kullanılarak veya maksimum olabilirlik tahmincisi35 aracılığıyla zamana dayalı ve yoğunluğa dayalı kararlı durum floresan anizotropisinin hesaplanmasını içeren daha fazla analiz için entegre edilir. Tek moleküllü olaylardaki sınırlı foton sayısı nedeniyle, maksimum olabilirlik tahmincisi yalnızca tek bir üstel bileşeni dikkate alır ve daha fazla tartışılmayacaktır.
Tek molekül olaylarının iki boyutlu bir histogramında, ortalama floresan ömrü (τ) ve anizotropi (rxy), ortalama bir dönme süresi olarak (ρ) elde etmek için Perrin'in denklemi29,61 ile ilişkilendirilebilir.
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq08.jpg" style="margin: auto;">(3)
Spesifik ρ değerleri, farklı patlamaların fotonlarının, denklem 2'nin parametrelerini deneysel bozunmaya (seTRFA) optimize ederek analiz edilebilen birleşik zaman çözümlü floresan anizotropi bozunmasına entegre edildiği "alt topluluk" (se) analizi ile daha yüksek bir kesinlikle elde edilebilir. Zamanla çözülen anizotropi, ns zaman çerçevesi içinde meydana gelen floresan emisyonu içindeki biyomoleküllerin dönme hareketleriyle (yerel ve küresel) ilişkili heterojenliği ve dinamikleri çözebilir.
Tek molekül olaylarındaki dinamikleri tespit etmek için (milisaniye altı ölçekte), zamanla çözülen anizotropi Patlama Varyans Analizi'ni (traBVA)57 tanıttık. TraBVA'da, Mi ardışık foton segmentleri içeren bir foton patlaması için, patlamalar için fazla anizotropi varyansı (s2)
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq09.jpg" style="margin: auto;">.     (4)
Tek bir anizotropik durum için, σ2 varyansı yalnızca atış gürültüsünden65 kaynaklanır (sn: √N, burada N foton sayısıdır)
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq10.jpg" style="margin: auto;">(5)
burada m, bir patlamadaki fotonların sayısıdır. Bu nedenle, anizotropideki ek varyansı tanımlamak için, konformasyonel heterojenliğe bağlı aşırı anizotropi varyansını (S2) denklem 4 ve 5 arasındaki fark olarak tanımlayabiliriz.
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq11.jpg" style="margin: auto;">(6)
Tek tek moleküllerin gözlemi sırasında meydana gelen dinamikleri yakalamak ve varyans yaklaşımını dikkate almak için dinamik anizotropi Foton Dağılım Analizi (daPDA)55,56 kullanılabilir. daPDA'da, floresan yoğunluğu, binom dağılımı olarak ifade edilen bir koşullu olasılık (<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq12.jpg" style="margin: auto;">) izlenerek modellenir.
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq13.jpg" style="margin: auto;">(7)
Birlikte, bir Poisson dağılımını takip eden arka plan sayım oranının bir tahmini ile
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq14.jpg" style="margin: auto;">(8)
burada <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq15.jpg" style="margin: auto;"> ayarlanan zaman penceresi başına ortalama arka plan foton sayısıdır. Paralel ve dik arka plan sayımları ve <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq17.jpg" style="margin: auto;">, referans olarak tampon numuneler <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq16.jpg" style="margin: auto;"> kullanılarak ölçülebilir. Deneysel olarak belirlenen floresan anizotropisi, kinetik değişiklikleri içerebilen polarizasyon kanalı başına bir floresan yoğunluğu dağılımı ile bir liyakat χ2 rakamının en aza indirilmesiyle optimize edilir.
Sağlanan analiz rutinleri ve veri temsilleri, toplanan verilerin yorumlanması için kapsamlı bir yaklaşım sunar. Bu protokol esas olarak nanosaniyelerden milisaniyelere kadar anizotropi değişikliklerini yakalamada sınırlı olan konfokal ölçümlere odaklansa da, floresan anizotropisini daha uzun zaman ölçeklerinde izlemek için bir Toplam İç Yansıma mikroskobu benimsemek mümkündür ve bu da zaman serisi analizini mümkün kılar66. Tek moleküllü konfokal ölçümler için, gözlemlenen topluluğun benzersiz bir parmak izini oluşturan çok boyutlu histogramların kullanımını vurguluyoruz. Seçilmiş popülasyonlardan yeniden yapılandırılan zamana bağlı floresan bozunumları, nanosaniye ölçeğinde floresan anizotropisinin evrimini izleyebilir (Şekil 3). Foton dağılımı analizi 55,56 ve patlama varyans analizi (BVA)57,58, zaman çözümlü bozunmalar ve çok boyutlu histogramlar arasındaki ara zaman ölçeklerindeki dinamikleri de yakalayabilir. Bu protokol, nanosaniye ile milisaniye zaman ölçekleri arasında köprü kurabilen darbeli uyarma67,68 olsun veya olmasın polarizasyon floresan korelasyon spektroskopisinin (FCS) kullanımını kapsamamakla birlikte, aynı veriler FCS69'u hesaplamak için kullanılabilir, ancak bu, sunulan protokolün kapsamı dışındadır. Bu tür deneyler yapılırsa, daha uzun numune ölçüm süresi önerilir.
Bu yaklaşım, insan FoxP proteinleri gibi karmaşık bir sisteme uygulanmış ve etki mekanizmalarında yer alan hareketler hakkında değerli bilgiler sağlamıştır. FoxP proteinleri, beyin ve akciğer gelişimi gibi çeşitli fizyolojik yönlerde yer alan transkripsiyon faktörleridir; Daha da önemlisi, farklı mutasyonların bu proteinlerin işlevini bozduğu kabul edilmiştir70,71. FoxP1'in DNA bağlama alanını bir model olarak kullanarak, hareketler için bir izleyici olarak bir BODIPY-FL boyasını tanıtmak için farklı tek sistein mutantları ürettik (Şekil 4A). Aslında, dimerizasyonun ve DNA bağlanmasının etkisini bu proteinin ana yapısal düzenleyicileri olarak değerlendirdik. SmFA yaklaşımını kullanarak, 2D-smFA grafikleri oluşturduk ve monomerik ve dimerik koşullarda her mutant için traBVA ve daPDA yaptık. İncelenen tek mutantlardan birinin bir örneğini gösteriyoruz (Şekil 4). Anizotropi davranışı, yüksek ve düşük dönme korelasyon sürelerini ve dolayısıyla muhtemel, düzensiz ve katlanmış toplulukları belirleme açısından tüm mutantlarda benzerdir. Yine de, her bir topluluğun fraksiyonu ve kinetiği açısından tüm mutantlarda oldukça heterojendir, dimerizasyon ve DNA bağlanmasından etkilenen farklı düzenden bozukluğa geçiş değişikliklerini kanıtlar ve zincir boyunca yapısal dinamiklerin yüksek çözünürlükte tanımını gösterir (Şekil 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig01.jpg"> 
Şekil 1: Dinamik biyomolekül aralığı ve floresan anizotropi yöntemleri. (A) İlgilenilen biyomolekülün omurgası boyunca çeşitli konumlara bağlı küçük floroforların anizotropisi, yerel yapısal dinamikleri bilgilendirir. (B) Floresan yoğunluğu bozunmaları (zamana bağlı floresan anizotropisi, FA) ve konfokal tek moleküllü mikroskop verilerinin tek moleküllü histogramları ile incelenen zaman ölçekleri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig02.jpg"> 
Şekil 2: Tek moleküllü floresan anizotropi veri kaydı ve işlenmesi. (A) Serbestçe yayılan moleküller, tek bir doğrusal polarize uyarma lazeri (bizim durumumuzda mavi) ile donatılmış konfokal tek moleküllü bir mikroskop kullanılarak analiz edilir. Floresan emisyonu (bizim durumumuzda yeşil), bir ışın polarizörü sinyali iki polarizasyona (uyarma kaynağına paralel, <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq18.jpg" style="margin: auto;">ve dikey) <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq19.jpg" style="margin: auto;">böldükten sonra iki dedektör tarafından tespit edilir. (B) Tespit edilen her foton üç parametre ile karakterize edilir: mikro zaman, makro zaman ve kanal tipi. Veriler, Zaman Etiketli Zaman Çözümlü (TTTR) biçiminde saklanır72. (C) Gözlemlenen her molekül için floresan anizotropisi dahil olmak üzere floresan parametrelerini çıkarmak için tek tek moleküllerin patlamaları seçilir ve işlenir. (D) Veriler, floresan ömrüne karşı floresan anizotropisinin iki boyutlu grafikleri ve zamanla çözülen anizotropi bozunmaları dahil olmak üzere çeşitli şekillerde temsil edilir. Bu temsiller, floresan ömürlerinin, dönme korelasyon sürelerinin ve sistem heterojenliğinin hem görsel hem de nicel olarak belirlenmesine izin verir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig03.jpg"> 
Şekil 3: FoxP1 alan adı değiştirilmiş dimer için temsili veriler. (A) Floresan anizotropisinin (rsaçılması) bir kontur grafiği olarak molekül başına ortalama floresan ömrüne karşı korelasyonu. Sırasıyla 0.2 ns ve 8.5 ns'nin ρ 1 ve ρ2'si dikkate alınarak, molekülün topluluk ortalamasının bir temsilcisi olarak iki dönme bileşeni için tek bir Perrin denkleminin üst üste bindirilmesi. (B) Alt topluluk zaman çözümlü floresan bozunmaları, numunenin zaman çözümlü floresan anizotropisini hesaplamak için kullanılır. Denklem 2 ile uyum, floresan anizotropisinin yerel ve küresel bileşenlerini çözdü. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig04.jpg"> 
Şekil 4: Tek moleküllü floresan anizotropisi (smFA) kullanılarak izlenen milisaniye altı FoxP1 dinamikleri. (A) Monomerik FoxP1 yapısının karikatür temsili. (B) İki boyutlu bir histogram, dinamik heterojenliği gösterir ve zamanla çözülen floresan anizotropisi ile tanımlanan iki farklı dönme korelasyon süresini ortaya çıkarır. Zamanla çözülen anizotropi Patlama Varyans Analizi (traBVA), büyük anizotropi sergileyen aşırı varyansa (Eşitlik 6) sahip küçük bir olay alt kümesini ortaya çıkarır. Foton Dağılım Analizi (PDA) kullanan kantitatif dinamik anizotropi analizi, bu işlem için döviz kurlarını daha da çıkarır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig05.jpg"> 
Şekil 5: Dimerizasyon sırasında FoxP1'in yerel ve küresel hareketlerinin taranması. (A) Bir çizgi film temsili, monomerik FoxP1'i dimerik formuyla karşılaştırır. (B) Monomerik ve dimerik koşullar altında konum başına ortalama aşırı varyans gösterilir ve daha büyük aşırı varyans anizotropide daha önemli değişiklikleri gösterir. (C) Foton Dağılım Analizi (PDA) kullanan dinamik anizotropi analizi, DNA'nın yokluğunda (yeşil) ve varlığında (sarı) popülasyon fraksiyonlarının (koyu renklerde yüksek anizotropi ve açık renkte düşük anizotropi) belirlenmesine yardımcı olur. Bu yaklaşımda, yerel ve küresel davranışlar arasındaki geçişler için oranlar (gösterilmemiştir) tahmin edildi ve bu da FoxP1'in kısmi açılmaya uğradığını ortaya koydu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Biyomoleküllerde Yerel Esnekliği Karakterize Etmek için Tek Moleküllerden Zamanla Çözülen Floresan Anizotropisi

We describe a protocol for conducting time-resolved fluorescence anisotropy at the single-molecule level using confocal microscopy to investigate the ...

time-resolved-fluorescence-anisotropy-from-single-molecules-for

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biyokimya

Biz tek hücreleri üzerinde floresan kullanarak yapı değişiklikleri siteye özgü analizi ile birlikte membran proteinlerinin iyon taşıma kinetiği ölçen bir yöntem anlatacağım. Bu teknik, iyon kanalları ve iyon pompaları uyarlanabilir ve protein altbirimden arasındaki mesafe sınırlamaları belirlemek için kullanılabilir.

Membran Proteinleri Konformasyonel Dynamics incelenmesi In situ Site Floresan Etiketleme

Protein etkileşimleri bir hücrenin işlevi merkezinde yer alıyor. Kalorimetre ve spektroskopik teknikleri yaygın onları karakterize etmek için kullanılır. Burada Shwachman-Diamond Sendromu (SBD'ler) mutasyona uğramış protein ve Uzama faktörü benzeri 1 GTPaz (EFL1) arasındaki etkileşimi incelemek için bir araç olarak floresan anizotropi açıklar.

Protein-protein etkileşimleri çalışmak için aracı olarak floresan Anizotropi

TIRF mikroskobu ile büyük verici-alıcı ağlardan smFRET verilerini elde etmek için kurulum ve deneysel prosedürü sunuyoruz. Bu ölçümlerin Bayes çıkarım yazılımı Fast-NPS ile adım adım analizi, uyarlanmış boya modellerinin uygulanması yoluyla yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler verir.

Tek molekülün yapısal bilgiler Hızlı Nano konumlandırma Sisteminin Kullanılması Deneyler FRET

Tek molekül seviyesinde yüksek hassasiyetli FRET deneyleri için bir protokol burada sunulmuştur. Buna ek olarak, bu metodoloji, N-metil-D-aspartat (NMDA) reseptörünün ligand bağlama alanındaki üç konformasyonel durumu tanımlamak için kullanılabilir. Kesin mesafelerin belirlenmesi FRET deneylerine dayanan yapısal modellerin oluşturulmasına yönelik ilk adımdır.

Biyomolekül Yapısının Belirlenmesi İçin Tek Molekül Seviyesinde Yüksek Hassasiyetteki FRET

Burada, üç renkli smFRET veri ve onun analizi ile 3D ensemble gizli Markov modeli elde etmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu yaklaşım ile bilim adamları Kinetik bilgi cooperativity veya ilişkili etkileşimler de dahil olmak üzere karmaşık protein sistemlerden ayıklayabilirsiniz.

Üç renkli tek molekül FRET Protein etkileşimleri korelasyon çalışma için kullanma

Burada sunulan HJ çözünürlüğü çalışma için tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi gerçekleştirmek için bir protokoldür. Dissosilasyon sabitlerini belirlemek için iki renkli alternatif uyarma kullanılır. Tek renkli zaman atlamalı smFRET daha sonra HJ çözünürlüğünden önce çalışma süresi dağılımını elde etmek için gerçek zamanlı dekolte tahlillerinde uygulanır.

HOLLIday Kavşak Çözünürlüğünün GEN1 Tarafından Gerçek Zamanlı İncelenmesi için Tek Moleküllü Förster Rezonans Enerji Transfer Yöntemleri

Bu makalede, açık kaynaklı, ucuz smfBox'ı kullanarak biyomolekülleri serbestçe dağıtarak, açmadan hizalamaya ve odaklanmaya, veri toplama ve analize kadar, bireysel olarak tam olarak düzeltilmiş doğru FRET ölçümleri yapmak için adım adım yönergeler sağlanır.

Açık Kaynaklı smfBox kullanarak Hassas ve Doğru Tek Moleküllü FRET Ölçümleri Yapma

Zaman çözümlenmiş tek moleküllü protein kaynaklı floresan geliştirme, proteinlerdeki yerel yapısal değişikliklere duyarlı yararlı bir floresan spektroskopik yakınlık sensörüdür. Burada, daha uzun menzilli FRET cetveli kullanılarak ölçüldüğünde küresel olarak yapılandırılmamış ve kararsız olarak bilinen α-Synuclein'deki kararlı yerel konformasyonları ortaya çıkarmak için kullanılabileceğini gösteriyoruz.

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Modern floresan etiketleme tekniklerini kullanarak canlı hücrelerdeki membran reseptör dinamiklerini incelemek için Förster Rezonans Enerji transferi (FRET) ile birlikte canlı hücre çift renkli floresan çapraz korelasyon spektroskopisi (FCCS) gerçekleştirmek için deneysel bir protokol ve veri analizi iş akışı sunuyoruz.

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

Bu makalede, geniş alan floresan mikroskopisi kullanılarak mobil, tek moleküllü Förster rezonans enerji transferi (smFRET) tabanlı probların mekansal analizi için bir yöntem sunulmaktadır. Yeni geliştirilen yazılım araç seti, doğru FRET verimliliği ve moleküler konumlar da dahil olmak üzere hareketli probların smFRET zaman izlerinin zamanın işlevleri olarak belirlenmesini sağlar.

Mobil Tek Moleküllü FRET Problarının Otomatik İki Boyutlu Mekansal Analizi

Bu çalışma, doğal olmayan amino asit (UAA) dahil etme yoluyla bölgeye özgü etiketleme kullanarak G proteinine bağlı reseptörler (GPCR'ler) üzerinde tek moleküllü floresan rezonans enerji transferi (smFRET) deneyleri gerçekleştirmek için ayrıntılı bir prosedür sunmaktadır. Protokol, smFRET numune hazırlama, deneyler ve veri analizi için adım adım bir kılavuz sağlar.

Tek Moleküllü FRET Kullanarak Membran Reseptörlerinin Konformasyonel Dinamiğinin Görselleştirilmesi

Öğrenin tek molekül düzeyinde biyomoleküllerin yerel esnekliğini ve dinamiklerini zamanla çözülen floresan anizotropisi ile nasıl karakterize edilir. Bu yöntem FoxP1 proteini gibi yapıların davranışlarını incelemek için kullanılır.

Biyomoleküllerde Yerel Esnekliği Karakterize Etmek için Tek Moleküllerden Zamanla Çözülen Floresan Anizotropisi

Daha fazla video keşfet