Nörorejenerasyonun Görüntülenmesi için Kanallı Agar Pedleri Üzerinde Caenorhabditis elegans Oryantasyonunun İnce Ayarlanması

Laboratuvarımızın birincil odak noktası, model organizma C.elegans'ı kullanarak memeli merkezi sinir sistemi rejenerasyonunun altında yatan mekanizmaları tanımlamaktır. Birden fazla nöronda rejenerasyonu inceliyoruz ve gelişmiş merkezi sinir sistemi rejenerasyonuna yol açan ön koşullandırma sinyalinin kimliğini arıyoruz. Mevcut deneysel zorluklar arasında, vinil plak üzerindeki cam plakanın değiştirilmesi ve tek tip bir kalıp kalınlığı elde edilmesi sırasında hava kabarcıklarının eklenmesi yer almaktadır.

Bununla birlikte, PDMS kalıbı oluşturulduktan sonra, çeneler için yeniden kullanılabilir. Ele aldığımız araştırma boşluğu, yetişkin hayvanların yönelimi üzerinde sınırlı kontroldür. Yetişkin hayvanların çapı daha büyüktür ve daha pigmentlidir, bu da daha derin Z düzlemlerinde görüntüleme sorunlarına neden olur.

Ek olarak, kapak fişi girişi de ilk yönü değiştirir. Kanallar, kapak kayması girişinde hayvanların oryantasyonunu korumaya yardımcı olur ve hedef hücrelerin görüntüleme hedefine daha yakın olmasını sağlar. Kanallar ayrıca hayvanlar üzerindeki stresi azaltır, normal fizyolojiyi teşvik eder, doğrusal hayvan konfigürasyonunu teşvik eder ve birden fazla hayvanda görüntüleme yaparken tutarlılık yaratır.

Başlamak için, hızlı kürleme maddesinin tabana bir ila 10 oranını tek kullanımlık bir tartım kabına dökün. Kürlenmemiş sıvıyı tamamen bütünleşene ve kabarcıklarla dolana kadar 45 saniye boyunca iyice karıştırın. Ardından, kürlenmemiş PDMS karışımını içeren tepsiyi eğimli bir vakumlu desikatöre yerleştirin.

Hava kabarcıklarının yüzeye çıkmasına izin vermek için eksi 0,09 kilo paskal ile eksi 0,1 kilo pascal arasındaki basıncı üç kez değiştirin. Vinil plağı ve cam plakayı deiyonize su ile iyice durulayın ve daha fazla kullanmadan önce vinil plağın tamamen kurumasını bekleyin. Fazla PDMS'yi yakalamak için sıcak plakanın üzerine bir alüminyum folyo tabakası yerleştirin.

Ardından, kalıp kalınlığını ayarlamak için vinil plağın her iki ucuna bir cam sürgü yerleştirin ve cam bölmeyi kürlenmemiş PDMS'ye bastırırken eşit bir yükseklik sağlayın. Şimdi, kürlenmemiş PDMS sıvısını vinil plağın bir tarafına dökün. Sıkışan havanın dışarı çıkmasına izin vermek için cam plakayı eğin ve yavaşça aşağı indirin.

Daha sonra PDMS'yi 100 santigrat derecede 20 dakika sertleştirin. Vinil plağı sıcak plakadan çıkarın ve soğumaya bırakın. Bundan sonra, yırtılmayı önlemek için PDMS'yi vinil plaktan dikkatlice soyun.

Ardından PDMS'yi cam panelden soyun. Kılavuz olarak yeni bir cam sürgü kullanarak, kanallı bir agar kalıbı oluşturmak için PDMS'yi keskin bir usturayla kesin. Son kesilmiş kanallı agar kalıbını göstermek için fazla PDMS'yi soyun.

Bir şişeye 0.6 gram agar ve 30 mililitre nematod büyüme ortamı sıvı stoğu ekleyin. Şişeye bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve karışımı 120 santigrat dereceye ayarlanmış sıcak bir plaka üzerinde ısıtın. Jel eridikten sonra 120 mikrolitre sodyum azid stok çözeltisi ekleyin.

Ardından PDMS kalıbını suyla iyice yıkayın ve kurumaya bırakın. Kullanıma hazırlamak için PDMS kalıbını iki set slayt çifti arasına yerleştirin. Bir pipet kullanarak, pipet ucunu ısıtmak için agar solüsyonunu yukarı ve aşağı çekin ve 300 mikrolitre erimiş agarı PDMS kalıbına pipetleyin.

Son olarak, bir mikroskop lamını doğrudan agarın üzerine yerleştirin ve yanlardaki slaytların üzerinde durduğundan emin olun. Agar tamamen soğuduktan sonra sürgüyü çıkarın. Kanallı agar pedleri, ters çevrilmiş bir mikroskoba aktarılmadan önce floresan diseksiyon mikroskobu altında doğrulanan vulva ve S-şekilli bağırsak gibi yer işaretlerini hizalamak için hayvanı yuvarlayarak Caenorhabditis elegans'ın hassas oryantasyonunu kolaylaştırdı.

Floresan görüntüleme, Caenorhabditis elegans'ın floresan mikrograflarda gösterildiği gibi kanallı agar pedleri üzerindeki doğru oryantasyonunu doğruladı. Kanallı agar pedleri, rejenere nöron liflerini objektif lense daha yakın konumlandırarak, ışık saçılımını ve emilimini en aza indirerek nöronal rejenerasyon için görüntüleme kalitesini iyileştirdi.