Sıçanlar İçin Doğrudan Vagus Sinir Enjeksiyon Protokolü

Gen replasman tedavisinde preklinik çalışmalar yürütüyoruz. Otonomik ve periferik sinir sistemleri sorunlarını ele almak için en uygun ilaç verme yöntemini oluşturmak için laboratuvar hayvanlarını kullanıyoruz. Vektör tabanlı gen replasman tedavisi, gen terapisinde gelişmekte olan teknolojilerden biridir. Adino ile ilişkili viral vektörün uygulanması, şu anda mevcut olan potansiyel seçeneklerden biridir. AAV9, ilgilenilen geni merkezi ve periferik sinir sistemine iletmek için gen terapisi araştırmalarında yaygın olarak kullanılmaktadır. Araştırmacılar, ilaç ajanlarını doğrudan periferik sinir sistemine iletmek için yeterli seçeneğe sahip değildir. Periferik veya otonom sinir sisteminin neden olduğu nörolojik bozuklukları içeren durumlar vardır. Bununla birlikte, bu durumları ele almak için etkili bir ilaç verme yöntemi eksikliği vardır.

Bu yöntem, sıçanların kullanıldığı klinik öncesi çalışmalarda otonom sinir sistemi problemini ele almak için ilaç ajanlarını doğrudan Vagus sinirlerine vermenin bir yolunu göstermektedir. Ek olarak, bu yöntem, diğer türlerde gerekli modifikasyonlarla birlikte diğer periferik sinirler yoluyla ilaç vermek için ihraç edilebilir. Gri laboratuvar, hem kemirgenleri hem de büyük hayvanları kullanarak AV aracılı klinik öncesi gen terapisi araştırmalarına devam edecek. Ek olarak, gen replasman tedavisi stratejisini başlatmak için uygulanabilir yeni yöntemler geliştirmeye odaklandık.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, piston çıkarılmış halde 100 mikrolitrelik bir cam şırıngayı 27 gauge iğneye bağlayın. Yaklaşık 45 santimetre sterilize polietilen borunun bir ucunu 27 gauge iğneye bağlayın, ardından 27 gauge iğne ile üç mililitrelik plastik bir şırınga takın ve şırıngayı yaklaşık 0.5 mililitre% 0.9 normal salin ile yükleyin. Polietilen boruyu açık uçtan doldurmak için% 0.9 normal salin kullanın, borunun tam uzunluğunun ve cam şırınganın namlusunun salin taşana kadar doldurulmasını sağlayın. Bittiğinde, üç mililitrelik şırıngayı ve iğnesini çıkarın ve atın. Şimdi pistonu cam şırınganın namlusuna yerleştirin ve namlunun ortasına doğru hafifçe ileri doğru itin ve cam şırıngayı şırınga pompasına yerleştirin. Pistonu hafifçe geri çekmek için şırınga pompasını kullanın ve borunun açık ucunda yaklaşık 1,5 santimetrelik bir hava boşluğu oluşturun. En az beş mikrolitre boya ve aday ilaç karışımını 10 mikrolitrelik bir mikro pipet kullanarak sterilize edilmiş bir para film parçası üzerine pipetleyin. Aday ilaç karışımını şırınga pompası yardımıyla tüpe çekin ve enjeksiyon karışımının seviyesini bir işaretleyici ile işaretleyin. Boruya 35 gauge bir iğne takın ve cerrahi aşamada bantla temiz bir yüzeye sabitleyin, sabit kaldığından, sterilize edildiğinden ve başka hiçbir şeye dokunmadığından emin olun. Enjeksiyon çözeltisi iğne ucundan çıkmaya başlayana kadar şırınga pompasını 10 ila 15 saniye çalıştırın. Anestezi uygulanmış fareyi epilasyon ve bölge hazırlığı için donatılmış bir masaya aktarın. Aşırı kuruluğu önlemek için farenin her iki gözüne de suni yırtma merhemi sürün. Sıçan bilincini geri kazandığında ağrıyı kontrol etmek için onaylanmış kurumsal hayvan protokolüne göre analjezikler uygulayın. Boynun ventral tarafını servikal bölgede traş edin ve çeneden sternuma kadar her iki taraftaki orta hattan dik olarak yaklaşık iki santimetreye kadar uzatın. Traş edilen bölgeyi %70 etil alkol ve %10 Betadine ile üç kez sterilize edin ve dairesel bir şekilde dışa doğru silin. Sıçanı diseksiyon mikroskobu altında sırtüstü pozisyonda cerrahi aşamaya aktarın. Sıçanın altındaki ısıtma yastığının uygun şekilde temperlendiğinden emin olun ve ameliyat için servikal bölgeyi görselleştirmek için odaklanan mikroskopları ayarlayın. Sıçanları veya çene dişlerini emilmeyen bir sütürle asın. Anestezi boyunca burun deliklerini burun konisi içinde tutmak için dikişin açık ucunu burun konisinin içine sabitleyin. Fareyi, başı sağ elini kullanan cerrahın sol tarafında olacak şekilde konumlandırın. Hizalamak için boynun altına sterilize edilmiş bir gazlı bez yastığı yerleştirin ve servikal bölgeyi düzeltin. Farenin vücudunu sterilize edilmiş bir örtü ile örtün ve cerrahi alanı açıkta bırakın. Cerrahi aşamanın dört köşesine manyetik fiksatörlerle dört ekartör pimi sabitleyin. Şimdi, insizyonun yapılacağı servikal bölgenin orta hattına epidermal lokal anestezikler enjekte edin. Ventral servikal bölgede çene ve sternum arasındaki orta hatta iki santimetre uzunlamasına bir cilt kesisi yapmak için bir neşter bıçağı kullanın. Daha sonra sterilize edilmiş pamuk uçlarıyla, künt kesilen cilt kenarlarını ayırır. Ekartör uçlarını kullanarak, ayrılan cilt kenarlarını zıt yönlerde geri çekin. Daha derine inmek için fasyayı pamuk uçları kullanarak ayırın ve tükürük bezlerini yanlamasına itin. Şimdi, sternum mastoid kaslarını pamuk uçlarla ayırın ve ekartör pimleri ile yanal olarak geri çekin. Karotis kılıfı görünene kadar trakeanın sol tarafındaki dokuyu ayırmaya devam edin. Karotis artere zarar vermeden karotis kılıfında küçük bir delik oluşturmak için ince forseps kullanın ve sol vagus sinirini ana karotis arterden dikkatlice ayırın. Sinir, forseps kullanılarak arterden ayrıldıktan sonra, kancalamak için bir mililitrelik şırıngaya takılan 25 gauge kavisli bir iğne kullanın ve siniri baskın olmayan elinizle tutun. Aday ilaç boya karışımının yüklü olduğu iğneyi baskın elinizle tutun. Pürüzsüz bir iğneyi kolaylaştırmak için, 25 gauge kancayı kullanarak hafifçe çekerek siniri düz tutun. İğneyi sinirin içine yerleştirin ve iğneyi Vagus sinirine paralel tutarken 0,5 santimetreden daha fazla ilerletin. İğnenin yaklaşık 0,4 ila 0,5 santimetresi sinirin içinde kalacak şekilde hafifçe geri çekin. Tek bir iğne ile sinir delinmesinin sayısını en fazla üç kez sınırlayın. İğne yerleştirmeyi onayladıktan sonra, hareket etmeden konumunu koruyun ve şırınga pompasını açın. Sinirin içinde kaldığından ve düzgün bir şekilde aktığından emin olmak için infüzyonu izleyin. İlaç boya karışımının hareketini izlemek için infüzyon tüpü üzerindeki işaretli noktayı kullanın. Sinirin boyanın rengini geliştirmeye başladığını gözlemleyin. 25 gauge kavisli iğneyi çıkarın ve steril pamuk uçları kullanarak dokuları nazikçe orijinal konumlarına geri getirin. Ardından ekartör uçlarını çıkarın. Yarayı emilebilir veya emilmeyen bir dikişle kapatın ve yaranın mükemmel bir şekilde kapanmasını sağlamak için gerekirse dikişler arasına çok az miktarda doku yapıştırıcısı sürün.