Dalak ve Kardiyak Makrofajlarda ve Kemik İliği Monositlerinde Ex Vivo Metabolik Akının Analizi

Burada, kemik iliği, dalak ve enfarktüslü kalpten makrofajların çıkarılması ve ardından canlı hücrelerdeki metabolik akışın değerlendirilmesi için yöntemleri ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Araştırmamız miyokard enfarktüsü sırasında immünometabolizmanın rolüne odaklanmaktadır. Bağışıklık hücresi metabolizmasındaki değişikliklerin kardiyak yaralanma ve iltihaplanma sırasında fenotiplerini nasıl düzenlediğini anlamak istiyoruz.

Makrofaj metabolizmasının kardiyak yeniden şekillenme üzerindeki etkisini daha iyi anlamak için in vivo genetik yaklaşımları hassas hücre ekstraksiyonu, hücre fenotiplemesi, metabolik fenotipleme, transkriptomik ve metabolomik ile birleştiriyoruz.

Bu protokol, obezite veya diyabet gibi farklı hastalık koşulları altında MI'dan sonra makrofaj metabolizmasının nasıl değiştiğini ve farklı tedavilerin makrofaj metabolizmasını nasıl etkilediğini anlamamızı sağlar.

Bu teknik, taze ekstrakte edilmiş canlı makrofajların hızlı bir şekilde analiz edilmesini sağlar, böylece uzun süreli kültürlemeyi önler. Aynı hücrelerdeki diğer fenotipik değişikliklerin aynı anda değerlendirilmesine de izin verir.

Bu protokol, bize ve diğerlerine, farklı enflamatuar veya otoimmün durumlarda makrofaj metabolizmasını daha iyi anlamamızı sağlayacaktır. Diğer bağışıklık alt tiplerini incelemek için de modifiye edilebilir.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, deney faresinden bacak kemiklerini alın ve kemiğin her iki ucunu da dikkatlice kesin. 27 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırınga kullanarak, kemik iliğini PEB tamponu içeren 15 mililitrelik konik bir tüpe yıkayın. Süspansiyonu 300 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturun ve RBC'leri parçalayın. Daha sonra PEB tamponu ekleyin, ardından Fc reseptörü bloke edici reaktif ve monosit biyotin antikor kokteyli ile toplam yedi hücrenin gücüne beş kez 10 ekleyin. Karışımı karanlıkta dört santigrat derecede beş dakika inkübe edin. Hücreleri 10 mililitre PEB tamponu ile yıkayın ve süspansiyonu 300 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra, hücre peletini toplayın ve 500 mikrolitre PEB tamponu ve 100 mikrolitre anti-biyotin mikro boncuk içinde yeniden süspanse edin. Karışımı karanlıkta dört santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Şimdi, bir mililitre PEB tamponu olan bir stand üzerinde manyetik bir sütun hazırlayın. Hücre süspansiyonunu hemen kolona uygulayın ve 15 mililitrelik bir tüpte monositler içeren akışı toplayın. Kolonu bir mililitre PEB tamponu ile iki kez yıkadıktan sonra, bir hemositometre kullanarak akıştaki monositleri sayın. Monositleri bir sonraki adıma hazırlamak için, dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin. Akı analizi için, hücre peletini %0.1 FBS ile bir mililitre RPMI'de yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi için kalan hücreleri soğuk PEB'de tutun ve boyamaya devam edin. Testten bir gün önce sensör kartuşunu ambalajından çıkarın. Yeşil sensör plakasını kuyulardan ayırın ve her kuyucuğa 200 mikrolitre kalibrant sıvısı pipetleyin. Sensör plakasını tekrar kartuş plakasına yerleştirin, böylece sensörler kalibant sıvısına daldırılır. Kartuşu gece boyunca 37 santigrat derecede karbondioksit içermeyen nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra hücreleri 200 mikrolitre ortamla birlikte en az bir saat boyunca 96 oyuklu bir kültür plakasına yerleştirin. Metabolik akı ortamını test için hazırlayın. Glikoz, glutamin veya piruvat içermeyen bazal RPMI veya DMEM kullanın ve ortamı spesifik teste göre destekleyin. Kuyucuklardaki eski ortamı yeni hazırlanan bazal ortamla dikkatlice değiştirin ve bütünlüklerini doğrulamak için hücreleri mikroskop altında kontrol edin. Hücre plakasını 37 santigrat derecede karbondioksit olmayan nemlendirilmiş bir inkübatöre yerleştirin. Şimdi inkübatörden hidratlı sensör kartuşu akı plakasını alın ve test bileşiklerini glikoliz veya mitokondriyal stres testleri için hazırlayın. Akı plakası üzerindeki bağlantı noktalarına uygun hacimlerde test bileşikleri yükleyin. Şimdi yazılımı açın ve Mitokondriyal Stres Testi'ni seçin. Arka plan ölçümleri için en az bir kuyunun boş olduğundan emin olarak kullanılacak kuyuları seçin. Programı çalıştırmak için, yaklaşık 20 dakika süren kalibrasyon için akı plakasını kapağı olmadan yükleyin. Kalibrasyondan sonra, akı plakasının altını çıkarın ve hücre plakasını tutucuya yerleştirin. Yaklaşık 2,5 saat sürecek olan testi başlatmak için Çalıştır'a basın. Metabolik akı yazılımı veya diğer analitik araçları kullanarak sonuçları analiz edin. İki tibia ve iki femurdan alınan kemik iliği iyi miktarda monosit verdi. Flow sitometri, Ly6C için kardiyak ve splenik makrofaj heterojenitesini gösterirken, kemik iliği monositleri Ly6C için oldukça pozitifti. Hücre dışı asitlenme hızı ve oksijen tüketim hızındaki değişimler hat greftleri olarak gösterildi. Farelerde oruç tutmak, hem mitokondriyal hem de glikoliz stres testlerinde gözlendiği gibi, kemik iliği monositlerinde glikolizin azalmasına ve ECAR oranı ile OCR'nin artmasına neden oldu.