Kriyoseksiyon ile Drosophila Kalp Floresan Boyama için Yeni ve Etkili Yöntem

Araştırma laboratuvarım, yaşlanma ve metabolik bozukluğu incelemek, metabolik, kalp kası, uyku ve diğer yaşlanma hastalıklarına müdahale olarak zaman kısıtlı beslenme ve egzersizi araştırmak için drosophila modelini kullanıyor. Fizyolojik genetik ve beslenme stratejisi ile makine öğrenimi ve omik, 3D baskılı cihazlar ve makine öğrenimi yaklaşımlarını kullanarak drosophila testini kolaylaştırıyor. Drosophila kalplerinin floresan immünohistokimyası, genotipler ve yaşlar arasında çoklu protein tespitini mümkün kılar, ancak karmaşık diseksiyonlar, doku koruması ve belirli bir protein ekspresyon paternlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülenmesi gibi zorluklarla karşı karşıyadır.

Bu protokol, doku korunmasını, antikor penetrasyonunu ve görüntüleme çözünürlüğünü iyileştirerek kardiyak protein belirteçlerinin daha iyi görselleştirilmesini sağlar. Geleneksel tüm kalp montaj yönteminde karmaşık diseksiyon, doku hasarı ve sınırlı çözünürlük gibi zorlukları ele alır. Bu protokol, karmaşık diseksiyonu ortadan kaldırarak, tek elle yürütmeyi mümkün kılarak ve maliyetli konfokal mikroskopiden kaçınarak drosophila kalp araştırmalarının erişilebilirliğini artırır ve yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi daha uygun hale getirir.

Başlamak için, bir karbondioksit sinek matı kullanarak 5 ila 10 sineği uyuşturun. Sinekleri mikroskop altında 1X ila 2X büyütme ile görüş alanına yerleştirin. Yaylı makas kullanarak sineklerin kafasını kesin, kanatları kırpın ve bacakları çıkarın.

Gövde olarak adlandırılan göğüs ve karın bölgesini bir arada tutun. Bir fırça kullanarak, tüm deney grupları toplanana kadar gövdeleri buz üzerinde etiketli 1,5 mililitrelik tüplere nazikçe yerleştirin. Tüpleri buzdan çıkardıktan sonra, her tüpe pH 8'de 100 mikrolitre 10 milimolar etilen glikol tetraasetik asit ekleyin.

Tüm cisimlerin suya batırıldığından emin olun ve tüpleri 10 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Ardından, etilen glikol tetraasetik asit çözeltisini tüplerden çıkarın ve atın. Dokuyu 10 dakika boyunca yıkamak için her tüpe 100 mikrolitre PBS pipetleyin.

Yıkama işlemi sırasında tüpleri orbital çalkalayıcıya yerleştirin. PBS'yi attıktan sonra, her tüpe PBS çözeltisinde 100 mikrolitre% 4 paraformaldehit pipetleyin. Tüpleri 15 dakika boyunca 100 ünitelik bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve dokuların solüsyonla temas halinde kalmasını sağlayın.

Ardından paraformaldehit çözeltisini atın. Son yıkama tamamlandıktan sonra, gövdeleri PBS'de% 10'luk bir sükroz çözeltisine aktarın. Gövdelerin tüp içindeki çözelti ile temas halinde olduğundan emin olun.

Kuru buzu depodan alın ve küçük bir metal veya plastik tepsiye yerleştirmek için birkaç parça seçin. Kalıbın yerleştirilmesine izin veren boyutlara sahip bir tepsi seçin ve doğrudan tek bir büyük ve düz kuru buz parçasının üzerine yerleştirin. Etiketli bir kalıbı, kabarcıkları en aza indirmek için yavaşça dökerek optimum kesme sıcaklığı veya OCT bileşiği ile %50'ye kadar doldurun.

Bir fırça ile, disseke edilmiş ve sabitlenmiş drosophila cisimciklerini kalıbın içindeki OCT bileşiğinin yüzeyine dikkatlice yerleştirin. Forseps kullanarak, her bir gövdeyi, göğüs kafesinin ve karın bölgesinin sırt duvarı genellikle alt kısım boyunca hizalanacak şekilde kalıbın altına itin. Gövdeleri, karın kalıbın dibi boyunca düz duracak şekilde ayarlayın.

Her bölümün tüm konuları aynı anda içermesini sağlamak için X, Y ve Z boyutlarındaki tüm gövdeleri hizalayın. Özellikle erkeklerde karın eğriliğini, vücutları delmeden veya ezmeden mümkün olduğunca düzleştirmek için düzeltin. Tüm denekler yerine oturduktan sonra, kalıbı, alt kısım doğrudan bir parça kuru buzun üzerine oturacak şekilde konumlandırın.

OCT bileşiğinin temas halinde donmaya başladığından emin olun ve tüm denekler kalıba tamamen girene kadar devam edin. Dondurulduktan sonra, tamamen donmaya izin vermek için kalıbı eksi 20 santigrat dereceye ayarlanmış bir dondurucuya aktarın. Tamamen donduktan sonra, kalıbın kalan kısmını OCT bileşiği ile doldurun.

Kalıba bir ayna ucu takmak için, bloğa bol miktarda OCT bileşiği uygulayın. Ucu bileşiğin üzerine düz bir şekilde bastırın ve kriyostatta tipik olarak beş dakika içinde tamamen donmasına izin verin. Ardından ayna ucunu ve OCT bloğunu kalıptan çıkarın.

Ucu aynaya yerleştirin, bloğun yukarıdan aşağıya doğru düzgün bir şekilde yönlendirildiğinden emin olun ve ucu sabitlemek için ayna anahtarını sıkın. Şimdi, ayar düğmelerini ve ayna derinliği kontrollerini kullanarak bloğu bıçakla hizalayın ve kesit genişliğini 20 mikrometre veya daha düşük bir değere ayarlayın. Yavaş ama tutarlı bir hareketle bloktan her dilimi kesin ve rulo önleyici camın kesildiği sırada her dilimi yakalamasına izin verin.

Isıtılmış slaytlar kullanarak bölümleri toplayın. Bir tıraş bıçağıyla, bölümleri çevreleyen fazla OCT bileşiğini çıkarın. Yıkama ve leke solüsyonlarını dokuyla sınırlı tutmak için hidrofobik bir işaretleyici kullanarak her slaytın kenarlığını çizin.

1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, slaytları dokuya dokunmadan her biri beş dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın. Son yıkamayı attıktan sonra, floresan leke solüsyonunu dokulara pipetleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Ardından, floresan lekesini atın ve slaytları PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Daha sonra, slayt üzerinde az miktarda çözelti bırakarak son PBS yıkamasını atın. 1000 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, dokuya doğrudan uygulamadan kaçınarak lam üzerine üç ila beş damla montaj ortamı pipetleyin. Forseps kullanarak, kapak kızağını bir kenara yerleştirin ve diğer tarafı sürgü ile aynı hizaya gelene kadar kademeli olarak indirin.

Slaytları neon veya parıltı olmadan oje ile kapatın. Montaj ortamı sertleşmiyorsa, floresan lekesine bağlı olarak hemen görüntüyü oluşturun veya slaytları daha sonra kullanmak üzere saklayın. Görüntülemeden önce, slaytları temizlik açısından inceleyin ve su solüsyonunda %70 etanol içeren bir mendil kullanarak nazikçe temizleyin.

Her floresan kanalı için uygun maruz kalma sürelerini seçmek için deneydeki en parlak floresan nesneleri analiz edin. Doğru pozlama ayarlarını onaylamak için her deney grubunu tüm kanallar için canlı görüntüde inceleyin. Tutarlılık için, aynı floresan kanalını kullanarak her konuya odaklanın ve tüm konular için görüntüler yakalayın.

Görüntülemeden sonra, ileride görüntü almak için slaytları karanlıkta dört santigrat derecede saklayın. Floresan görüntüleme yöntemi, drosophila kalbinin ostia, kapak, uzunlamasına lifler ve çevresel lifler gibi temel özelliklerini korudu. Tüm kalp tüpü yapısı ve ayrıntılı küçük yapılar, tüm yapı için 10X ve çevresel kasılma lifleri ve uzunlamasına stabilize edici lifler gibi daha ince ayrıntıları gösteren 40X ila 60X büyütme ile farklı büyütmelerde yakalandı.

Temsili floresan mikrografları, DAPI ile boyanmış çekirdekler, yeşile boyanmış lipitler ve falloidin ile kırmızıya boyanmış aktin içeren miyofibriller ile w1118 drosophila'da korunmuş kalp yapılarını gösterdi. Phalloidin boyama, uzunlamasına ve çevresel lifleri etkili bir şekilde vurgulayarak, donma ve kesit gerilmelerine rağmen korunmuş aktin filament yapısını gösterdi. Lipid nokta boyaması, kalp tüpünün yakınında lokalize yağ depolanmasını ortaya çıkardı.