Name: Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Öğrenin, yağsız ve obez farelerden primer murin adipositlerin izolasyonu ve kültürlenmesi yöntemini. Bu ölçeklenebilir protokol, obezite ve metabolik hastalıklarda adiposit fonksiyonlarını incelemek için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>Fonksiyonel ve Görüntüleme Çalışmaları için Murin Adipositlerinin ve Eksplantlarının Kültürlenmesi

<ol><li>Ward, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+U.S.+state-level+prevalence+of+adult+obesity+and+severe+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity.</a> N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).</li>
<li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li>
<li>Longo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+as+determinant+of+obesity-associated+metabolic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications.</a> Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).</li>
<li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+adiponectin+and+leptin%3A+Adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li>
<li>Johnston, E. K., Abbott, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+paracrine-%2C+autocrine-%2C+and+matrix-dependent+signaling+during+the+development+and+progression+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity.</a> Cells. 12 (3), 407(2023).</li>
<li>Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+adipose+tissue+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction.</a> Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+and+lipidomic+profiling+of+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissues+in+15+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates.</a> Sci Data. 10 (1), 453(2023).</li>
<li>Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-to-breast+cancer+crosstalk%3A+Comprehensive+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights.</a> Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).</li>
<li>Nahmgoong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+properties+of+adipose+stem+cell+subpopulations+determine+fat+depot-specific+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics.</a> Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).</li>
<li>Hildreth, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+human+white+adipose+tissue+identifies+new+cell+states+in+health+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity.</a> Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).</li>
<li>Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue at single-cell resolution.</a> Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+breast+tumorigenesis+through+taz-dependent+secretion+of+resistin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).</li>
<li>Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+liver-visceral+adipose+axis+during+hepatic+resection+and+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation.</a> Cells. 8 (9), 1100(2019).</li>
<li>Verma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-alpha-2-glycoprotein+secreted+by+triple-negative+breast+cancer+promotes+peritumoral+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis.</a> Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).</li>
<li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+repertoire+of+human+adipocyte+subtypes+develops+from+transcriptionally+distinct+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+human+white+adipocytes+cultured+under+membranes+maintain+identity%2C+function%2C+and+can+transdifferentiate+into+brown-like+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes.</a> Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).</li>
<li>Chaurasiya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+adipose+tissue+microvascular+endothelial+cell+isolation+and+establishment+of+co-culture+with+white+adipocytes+to+analyze+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication.</a> Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+pre-adipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice.</a> J Vis Exp. 167, e62005(2021).</li>
<li>Farrar, J. S., Martin, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+and+subsequent+differentiation+into+white+or+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes.</a> Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).</li>
<li>You, X., Gao, J., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+to+mechanically+isolate+stromal+vascular+fraction%3A+A+concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review.</a> Regen Ther. 27, 120-125 (2024).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+isolation+from+mouse+epididymal+adipose+tissue+and+sequencing+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).</li>
<li>Cho, D. S., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+adipose+progenitor+cells+from+mouse+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues.</a> J Vis Exp. 162, e61694(2020).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+human+adipose+tissue+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Next-generation human adipose tissue culture methods.</a> Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).</li>
<li>Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+mature+adipocytes+using+membrane+mature+adipocyte+aggregate+cultures+%28MAAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC).</a> J Vis Exp. 156, e60485(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100x Poloxamer 188 çözeltisi</td><td>Sigma</td><td>P5556-100mL</td><td></td></tr><tr><td>15 mL konik</td><td>Cellstar</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>21 G İğne</td><td>BD</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Şırınga</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Konik</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6,5 mm Transwell ile 0.4 & m Gözenekli Polikarbonat Membran Eki</td><td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümini (BSA)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500gm</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Plazma Membran Lekeleri</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>CL 316243 disodyum tuzu</td><td>Tocris</td><td>1499</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz Tozu</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM pheonol yok Kırmızı</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu (FBS)</td> <td>Gibco</td><td>A56708-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Doku Yolu Superfrost Plus Altın Slaytlar</td><td>Fisher bilimsel</td><td></td><td></td>1518848</tr><tr><td>Jel Yükleme Pipet Ucu</td><td>Fisher scientific</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX Takviyesi</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Gliserol Test Kiti</td><td>Abcam</td><td>AB133130</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>HEPES Tampon</td><td>Sigma</td><td>83264-100ml-F</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R Santrifüj</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75004271</tr><tr><td>Hoechst 33342 Çözelti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>İnkübasyon Mini Çalkalayıcı</td><td>VWR</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>Orta 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop Kapak Gözlükleri</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>SecureSeal Görüntüleme Ara Parçaları</td><td>Grace Biolabs</td><td>654006</td><td></td></tr><tr><td>Seive (SteeL İnce Gözenekli Kokteyl Süzgeci)</td><td>OXO</td><td>3112000</td><td>https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html</td></tr></tbody></table>

yağsız ve obez farelerden primer murin adipositlerinin İzolasyonu ve kültürlenmesi

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

Şekil 2'de gösterildiği gibi, uygun kıyma (Şekil 2B) ve sindirim (Şekil 2C), sağlam olgun adipositlerin izolasyonu için önemlidir. Yetersiz kıyma ve yetersiz sindirim, bağ dokusundan yetersiz ayrılma nedeniyle düşük olgun adiposit verimine neden olabilir. Görsel olarak bu, kıyma işleminden sonra kalan lifli doku ve kollajenaz solüsyonunda görünür topaklar ile gözlemlenebilir. Ek olarak, aşırı kıyma ve aşırı sindirim, olgun adipositlerin patlaması nedeniyle düşük verime neden olur. Görsel olarak bu, beyaz opak tabakanın kaybına ve büyük, berrak, serbest bir lipit tabakasının birikmesine neden olur. Uygun olmayan kıyma veya sindirim seviyeleri, zayıf adiposit izolasyonuna neden olur.
Yağ dokusunun uygun şekilde hazırlanması ve sindirilmesi, Şekil 3'te görüldüğü gibi dokunun dört ayrı katmana ayrılmasıyla sonuçlanacaktır. Serbest lipitlerin salınmasına neden olan adipositlerin bir miktar patlaması kaçınılmazdır; Bununla birlikte, uygun kıyma ve sindirim, minimum adiposit yırtılmasını sağlayacaktır. Kalan serbest lipid tabakası ve ortam, adipositlerin paketlenmesi sırasında çıkarılacaktır (Şekil 4). Adipositlerin uygun şekilde paketlenmesi, olgun adipositlerin verimli izolasyonu için gereklidir. Kalan herhangi bir serbest lipit veya ortam, zayıf izolasyona neden olacak ve kaplama, lipoliz ve hücre görüntüleme gibi aşağı akış fonksiyonel tahlillerini olumsuz yönde etkileyecektir.
Bu protokol, olgun adipositlerin temiz bir şekilde hazırlanmasını sağlar. Hücre görüntüleme ve lipoliz deneyleri, hücresel fonksiyonu değerlendirmek ve olgun adipositlerin izolasyon sonrası ve kültürlemeden sonra iki haftaya kadar işlevini koruduğunu göstermek için yapılabilir. Lipoliz testi, olgun adipositlerin, β-3 adrenerjik reseptörün uyarılması üzerine serbest gliserol salınımı yoluyla hücresel sinyalleşmeye yanıt verme yeteneğini koruduğunu gösterir (Şekil 6A, B). Bu yetenek, kültürde 2 hafta sonra bile korunur ve 24 saat boyunca kültürlenen yağ dokusu eksplantlarının lipoliz aktivitesi ile oldukça karşılaştırılabilir (Şekil 6C, D). Düşük kaliteli adipositler zayıflamış lipoliz gösterecektir. İzole adipositlerin hücre görüntülemesi, tek bir büyük lipid damlacığı içeren yuvarlak ve sağlam uniloküler matür adipositleri gösterir. Düşük kaliteli adiposit izolasyonları, patlamış adipositlerin göstergesi olan esas olarak büyük, hücre dışı yağ damlacıkları gösterecektir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig01.jpg"> 
Şekil 1: Yağ dokusu eksplantlarının gömülmesi. (A) Dokuyu gömmeden önce kısmen katılaşmış bazal membran matris kubbesinin görüntüsü. (B) Uygun olmayan ve uygun doku gömmenin temsili görüntüleri. Doku, kubbenin kısmen veya tamamen üzerinde yüzüyor gibi göründüğü için yanlış gömme görülebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig02.jpg"> 
Şekil 2: Yağ dokusunun uygun kıyma ve sindirim şeması. (A) Doku kıyma ve sindirim adımlarının şematik gösterimi 4.2-4.6. (B) Yetersiz, optimal ve aşırı kıyılmış dokunun temsili görüntüleri. Kıyılmış doku, orijinal şeklini koruyan büyük parçalara sahiptir. Aşırı kıyılmış doku, dokuyu çevreleyen serbest lipitlerde gözle görülür bir artışa neden olur, bu da berrak ve yağlı görünür. (C) Yetersiz, optimal ve aşırı sindirilmiş dokunun temsili görüntüleri. Yetersiz sindirilmiş doku, çözelti içinde kalan tüm doku parçalarını içerir. Aşırı sindirilmiş doku, çözeltiden hızla ayrılan büyük bir serbest lipit tabakası sergiler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig03.jpg"> 
Şekil 3: Sindirilmiş yağ dokusu katmanlarının ayrılması. (A) Adım 5.3'ü takiben mevcut olan katmanların şematik ve temsili görüntüsü. (B) Olgun adiposit tabakasını 50 mL konik tüpten çıkarmak için kesilmiş bir pipet ucunun kullanılması. (C) Kültür ortamını olgun adiposit tabakasının altından çıkarmak için iğne ve şırınga için uygun teknik ve yerleştirme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig04.jpg"> 
Şekil 4: Olgun adipositlerin sıralı paketlenmesi. Olgun adipositlerin paketlenmesinin sıralı görüntüleri. Serbest lipitler, adipositler ve ortam katmanları etiketlenir. Her dönüşün ardından serbest lipitler ve ortamlar uzaklaştırılır. Bu, bir dönüşten sonra adipositlerden hiçbir ortam veya serbest lipit ayrılmayana kadar tekrarlanır. Son görüntü, iyi paketlenmiş olgun adipositlerin temsilcisidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig05.jpg"> 
Şekil 5: Olgun adipositlerin kaplanması ve kültürlenmesi. (A) Olgun adipositlerin kaplamasının şeması. Kesilmiş bir p200 pipet ucu kullanılarak, paketlenmiş adipositler bir hücre kültürü ekinin zarına yerleştirilir. Ek daha sonra önceden doldurulmuş kültür ortamı kuyucuklarına ters çevrilir. (B) Kesilmiş pipet ucunu, adipositleri transwell eki üzerine bırakan kesilmiş pipet ucunu gösteren olgun adipositlerin kaplanmasının temsili bir görüntüsü. (C) Kuyucukların üstünden görüldüğü gibi, uygun şekilde paketlenmiş ve kötü paketlenmiş adipositlerin transkuyularla kaplanmış şemaları ve temsili görüntüleri. Düzgün paketlenmiş adipositler beyaz ve opak görünürken, zayıf paketlenmiş adipositler berrak lipid damlacıklarının oluşumuna neden olur. (D) Kültür ortamını değiştirmek için kullanılan tekniğin şeması. Ortamı transwell ekinin yan duvarındaki açıklıklardan dikkatlice çıkarmak için bir p200 pipet ucu kullanılır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig05large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig06.jpg"> 
Şekil 6: Olgun adipositlerin görüntülenmesi ve lipoliz testi. (A,B) Deri altı (A) ve viseral (B) olgun adipositlerden gliserol salınımı. Adipositler, normal bir yemek diyeti ile beslenen 16 haftalık C57BL / 6 erkek farelerden izole edildi. 30 μL adiposit, adım 7.1'de tarif edildiği gibi kaplandı ve 1 veya 10 gün boyunca kültürlendi. Adipositler 1 saat, 2 saat ve 4 saat boyunca 5 μM CL-316,243 ile muamele edildi ve süpernatanlar toplandı ve serbest gliserol için analiz edildi. (C,D) Subkutan (C) ve viseral (D) yağ dokusu eksplantlarından gliserol salınımı. Normal bir yemek diyeti ile beslenen 18 haftalık C57BL / 6 dişi farelerden yağ dokusu izole edildi. 0.1 g yağ dokusu eksplantı, adım 3.1-3.4'te tarif edildiği gibi kaplandı ve 24 saat boyunca kültürlendi. Adipositler 1 saat, 2 saat ve 4 saat boyunca 5 μM CL-316,243 ile muamele edildi ve süpernatanlar toplandı ve serbest gliserol için analiz edildi. N = A-D için 3 teknik kopya. Tüm veriler ortalama ± standart sapmadır. (E) İzole edilmiş deri altı ve viseral olgun adipositlerin temsili görüntüleri. Adipositler, normal bir yemek diyeti ile beslenen 16 haftalık C57BL / 6J erkek farelerden izole edildi. Adipositler plazma membran boyası (kırmızı) ve Hoechst nucleus boyası (mavi) ile boyandı. Ölçek çubukları: 50 μm; Büyütme: 60x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig06large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Seks</td>
			<td>Perhiz</td>
			<td>Depo</td>
			<td>Kıyma zorluğu</td>
			<td>Kollajenaz: Doku oranı</td>
			<td>Önerilen sindirim süresi (dk)</td>
			<td>Sıkma sıcaklığı.</td>
			<td>Yıkama sıcaklığı.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Dişi</td>
			<td rowspan="2">Normal yemek</td>
			<td>Subkutan</td>
			<td>Sert</td>
			<td>2:1</td>
			<td>12</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visseral</td>
			<td>Orta</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Yüksek yağlı diyet</td>
			<td>Subkutan</td>
			<td>Kolay</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visseral</td>
			<td>Kolay</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Erkek</td>
			<td rowspan="2">Normal yemek</td>
			<td>Subkutan</td>
			<td>Sert</td>
			<td>2:1</td>
			<td>14</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visseral</td>
			<td>Orta</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Yüksek yağlı diyet</td>
			<td>Subkutan</td>
			<td>Kolay</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visseral</td>
			<td>Kolay</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tablo 1: Cinsiyet, depo ve diyete özgü değişiklikler. Diğer depolara göre "Kolay", "Orta" veya "Sert" olarak tanımlanan her dokunun kıyma zorluğu. Gerçek kıyma süresinin araştırmacıya ve dokuya bağlı olarak değişeceğini unutmayın. Kollajenaz: Adım 4.1'de hazırlanan kollajenaz + DNaz çözeltisinin hacim (mL) olarak listelenen doku oranı, doku ağırlığına (g) eşittir. Sindirim süresi yaklaşık bir tahmindir, ancak gerçek sindirim süresi kıyma ve dokuya göre değişecektir. Araştırmacılar sindirimi protokolde açıklandığı gibi değerlendirmelidir. Sıkma sıcaklığı ve yıkama sıcaklığı erkek ve dişi fareler arasında farklılık gösterir. RT oda sıcaklığını gösterir.

Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Adipose tissue is primarily composed of mature, lipid-laden adipocytes by volume. These postmitotic cells play a critical role in energy storage and ...

Araştırmamız, farklı yağ depolarından ve diyet koşullarından gelen olgun adipositlerin işlevini araştırmaya odaklanmaktadır. Özellikle, olgun adipositlerin çevredeki hücrelerle nasıl iletişim kurduğunu ve bu karışmanın hastalığın ilerlemesini nasıl etkileyebileceğini ve obezitede nasıl değiştirilebileceğini anlamakla ilgileniyoruz. Olgun adipositler büyük ve hassas hücrelerdir, bu da FACS gibi yaygın olarak kullanılan hücre izolasyon yöntemlerini etkisiz hale getirir.Ayrıca, yağ dokusunda sıklıkla bulunan yüksek serbest lipid seviyeleri, olgun adipositler için toksik olabilir ve bu da bakımlarını zorlaştırabilir. Preadipositlerin in vitro farklılaşmasına dayanan yaygın olarak kullanılan yöntemlerin aksine, bu protokol fonksiyonel ve transkripsiyonel olarak in vivo adipositlere benzeyen ex vivo izole adipositleri incelememize izin verir. Bu özellikle önemlidir, çünkü adipositler yağ depoları arasında ve farklı diyet koşullarında büyük farklılıklar gösterir.Bu protokol, olgun adipositleri yansıtarak verimli bir şekilde izole eder ve kolayca ölçeklenebilir. Farklı cinsiyetteki farelerden ve farklı diyet koşullarına sahip farelerden adipositlerin izolasyonunu optimize etmek için ayarlamalar dahil edilmiştir. İzole edildikten sonra, adipositler kültürlenebilir, görüntülenebilir veya gerektiğinde başka bir şekilde kullanılabilir.Başlamak için, bir mililitre kollajenaz çözeltisine 0.00017 gram DNaz ekleyerek DNaz ile bir kollajenaz çözeltisi hazırlayın ve tam karışımı sağlamak için karışımı girdaplayın. Bir tıraş bıçağı kullanarak, izole edilmiş farelerin yağ dokusunu homojen görünene kadar kıyın. Daha sonra kıyma dokusunu steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.Hazırlanan kollajenaz ve DNaz çözeltisini kıyılmış yağ dokusuna ekleyin ve bileşenleri iyice karıştırmak için maksimum hızda yedi ila 10 saniye girdaplayın. Daha sonra 50 mililitrelik konik tüpleri 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede 220 RPM'ye ayarlanmış bir çalkalayıcıya yatay olarak yerleştirin. İnkübasyondan sonra, tüpleri çıkarın, beş saniye boyunca girdap yapın ve örnekleri kontrol edin.Şimdi serolojik bir pipet kullanarak, sindirilmiş dokuyu bir elekten geçirerek yeni bir steril 50 mililitrelik konik tüpe geçirin. Kollajenazı nötralize etmek için doku hacmine eşit FBS ve kollajenaz solüsyonunu elek yoluyla aynı konik tüpe ekleyin. Tüpleri burada gösterilen tabloda belirtilen sıcaklıkta üç dakika boyunca 300 G'de döndürün.Daha sonra 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, serbest lipitlerin üst tabakasını dikkatlice atın. Daha sonra, olgun adipositleri 10 mililitre büyüme ortamı içeren hazırlanmış 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için ucu kesilmiş bir P1000 pipeti kullanın. Olgun adipositler içeren 15 mililitrelik tüpleri, beyaz tabaka ortam boyunca dağılana kadar üç ila beş kez nazikçe ters çevirin.Tüpleri 10 dakika dinlendirdikten sonra, katmanları daha da ayırmak için önceden belirlenen sıcaklıkta döndürün. Bundan sonra, serbest lipitlerin üst tabakasını atmak için bir pipet kullanın. Şimdi beş mililitrelik bir şırıngaya 21 gauge iğne takın ve iğnenin alt kısmı olgun adiposit bölge tabakasının altına gelene kadar iğneyi tüpün kenarından dikkatlice kaydırın.Ardından, kültür ortamını ve hücresel kalıntıları çıkarmak için şırıngayı yavaşça yukarı çekin. Tüpe yavaşça 10 mililitre kültür ortamı ekleyin. Jel yükleme pipet uçlarını kullanma Olgun adiposit tabakasının altından kalan ortamı çıkarmak için ucu tüpün kenarından aşağı kaydırın.Daha sonra hücreleri bir dakika boyunca 100 G'de santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak serbest lipitleri çıkarın. Jel yüklemeli bir pipet ucu kullanarak, adipositlerin altındaki kültür ortamını çıkarın.Hücre kültürü eklerini doku kültürü ile muamele edilmiş 24 oyuklu bir plakadan çıkarın ve bunları zar tarafı yukarı bakacak şekilde davlumbazın yüzeyine yerleştirin. Plakanın alternatif kuyularını ılık kültür ortamı ile doldurun. Kesilmiş bir P200 pipet ucu kullanarak, 30 mikrolitre paketlenmiş olgun adipositi bir Transwell ekinin üstüne aktarın.Ardından Transwell ekini dikkatlice alın, ters çevirin ve 24 oyuklu plakada önceden doldurulmuş bir kuyuya yerleştirin. Ortamı kuyulardan çıkarmak için Transwell ekini sabit tutun ve yanlardaki küçük açıklıklardan bir P200 pipeti ile aspire edin. Ortamı çıkardıktan sonra, Transwell'i yerinde tutarken, kuyunun yan duvarı boyunca yavaşça bir mililitre taze ortam ekleyin.

isolation-culturing-primary-murine-adipocytes-from-lean-obese

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Nedeniyle obezite ve diğer yandaş arasındaki şiddetli ve negatif bağlantı, rol adipoz araştırma hastalığında oynadığı ve genel sağlık garantilidir. Biz izolasyon ve yerinde kullanarak adipoz çalışması için izin yağ depolarında eksizyonu ve in vitro yöntemler bir protokol mevcut.

Yerelleştirme, Kimlik ve Eksizyon Kemirgen Yağ depolarının

Membran olgun adiposit agrega kültürü (MAAC) kültür olgun insan adipositler için yeni bir yöntemdir. Burada insan yağlarından adipositleri nasıl izole edebileceğimizi ve MAAC'ı nasıl kurabileceğimizi ayrıntılarıyla anlatıyoruz.

Membran Olgun Adiposit Agrega Kültürleri (MAAC) Kullanarak İnsan Olgun Adipositlerin İzolasyon ve Kültürü

Bu protokol, adipojenik ve fibro-inflamatuar stromal hücre alt popülasyonlarını murin karın içi beyaz yağ dokusu (WAT) depolarından floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması veya immünmanyetik boncuk ayırma yoluyla izole etmek için teknik yaklaşımı açıklar.

Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Bu rapor, birincil kahverengi ve beyaz preadipositlerin yenidoğan farelerden eşzamanlı izolasyonu için bir protokol açıklanmaktadır. İzole hücreler kültürde yetiştirilebilir ve tamamen olgun beyaz ve kahverengi adipozitlere farklılaşmaya teşvik edilebilir. Yöntem, kültürdeki primer yağ hücrelerinin genetik, moleküler ve fonksiyonel olarak karakterizeini sağlar.

Primer Beyaz ve Kahverengi Preadipositlerin Yenidoğan Farelerden İzolasyonu ve Farklılaşması

Bu çalışmada, gen ve protein ekspresyon analizi için murin kahverengi adipositlerin izole edilmesinde yeni bir yöntem açıklanmaktadır.

Gen ve Protein İfade Analizi için Murin İnterskapüler Kahverengi Yağ Dokusundan Kahverengi Adipositlerin İzolesi

Bu protokol, fare preadipositlerinin deri altı yağdan izolasyonunu, olgun adipositlere farklılaşmasını ve insülin direncinin indüklenmesini açıklar. İnsülin etkisi, batı lekesi boyunca insülin sinyal yolunun üyelerinin fosforilasyonu / aktivasyonu ile değerlendirilir. Bu yöntem, primer adipositlerde insülin direncinin/duyarlılığının doğrudan belirlenmesini sağlar.

Primer Kültürde Diferansiye Fare Adipositleri: İnsülin Direncinin Bir Modeli

Burada, perivasküler yağ dokusu fonksiyonunun ve vasküler hücrelerle ilişkisinin incelenmesine izin vererek, fare periaortik yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyondan türetilen preadipositlerin izolasyonunu, kültürünü ve adipojenik indüksiyonunu açıklıyoruz.

Fare Periaortik Yağ Dokusundan Stromal Vasküler Fraksiyon Kaynaklı Preadipositlerin İzolasyonu, Kültürü ve Adipojenik İndüksiyonu

Ex vivo explant modeli kullanılarak, yağsız farelerden alınan visseral beyaz yağ dokusunun rostral kısmının küçük parçaları 7–10 gün boyunca kültürlenir; bu da yüksek yağlı diyet sırasında meydana gelen yağ dokusu iltihabının indüksiyonu ve incelenmesini mümkün kılar.

Yüksek Yağlı Diyet Benzeri Yağ Dokusu İltihaplanması için Deneyimli Fare Modeli

Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Bu yazıda, tümör infiltre lökositlerin oldukça saflaştırılmış nüfusu izole edilmesi için bir protokol tanımlamaktadır. Bu protokol, karmaşık tümör doku hücreleri izole edilmesi için, verim ve saflıkta geliştirmek için Miltenyi Biotech protokolü uyarlanmıştır.

Primer Tümörler gelen Bağışıklık Hücre İzolasyonu

Öğrenin, yağsız ve obez farelerden primer murin adipositlerin izolasyonu ve kültürlenmesi yöntemini. Bu ölçeklenebilir protokol, obezite ve metabolik hastalıklarda adiposit fonksiyonlarını incelemek için güvenilir bir araç sunar.

Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Daha fazla video keşfet