Yağsız ve Obez Farelerden Primer Murin Adipositlerinin İzolasyonu ve Kültürlenmesi

Araştırmamız, farklı yağ depolarından ve diyet koşullarından gelen olgun adipositlerin işlevini araştırmaya odaklanmaktadır. Özellikle, olgun adipositlerin çevredeki hücrelerle nasıl iletişim kurduğunu ve bu karışmanın hastalığın ilerlemesini nasıl etkileyebileceğini ve obezitede nasıl değiştirilebileceğini anlamakla ilgileniyoruz. Olgun adipositler büyük ve hassas hücrelerdir, bu da FACS gibi yaygın olarak kullanılan hücre izolasyon yöntemlerini etkisiz hale getirir.

Ayrıca, yağ dokusunda sıklıkla bulunan yüksek serbest lipid seviyeleri, olgun adipositler için toksik olabilir ve bu da bakımlarını zorlaştırabilir. Preadipositlerin in vitro farklılaşmasına dayanan yaygın olarak kullanılan yöntemlerin aksine, bu protokol fonksiyonel ve transkripsiyonel olarak in vivo adipositlere benzeyen ex vivo izole adipositleri incelememize izin verir. Bu özellikle önemlidir, çünkü adipositler yağ depoları arasında ve farklı diyet koşullarında büyük farklılıklar gösterir.

Bu protokol, olgun adipositleri yansıtarak verimli bir şekilde izole eder ve kolayca ölçeklenebilir. Farklı cinsiyetteki farelerden ve farklı diyet koşullarına sahip farelerden adipositlerin izolasyonunu optimize etmek için ayarlamalar dahil edilmiştir. İzole edildikten sonra, adipositler kültürlenebilir, görüntülenebilir veya gerektiğinde başka bir şekilde kullanılabilir.

Başlamak için, bir mililitre kollajenaz çözeltisine 0.00017 gram DNaz ekleyerek DNaz ile bir kollajenaz çözeltisi hazırlayın ve tam karışımı sağlamak için karışımı girdaplayın. Bir tıraş bıçağı kullanarak, izole edilmiş farelerin yağ dokusunu homojen görünene kadar kıyın. Daha sonra kıyma dokusunu steril 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın.

Hazırlanan kollajenaz ve DNaz çözeltisini kıyılmış yağ dokusuna ekleyin ve bileşenleri iyice karıştırmak için maksimum hızda yedi ila 10 saniye girdaplayın. Daha sonra 50 mililitrelik konik tüpleri 10 dakika boyunca 37 santigrat derecede 220 RPM'ye ayarlanmış bir çalkalayıcıya yatay olarak yerleştirin. İnkübasyondan sonra, tüpleri çıkarın, beş saniye boyunca girdap yapın ve örnekleri kontrol edin.

Şimdi serolojik bir pipet kullanarak, sindirilmiş dokuyu bir elekten geçirerek yeni bir steril 50 mililitrelik konik tüpe geçirin. Kollajenazı nötralize etmek için doku hacmine eşit FBS ve kollajenaz solüsyonunu elek yoluyla aynı konik tüpe ekleyin. Tüpleri burada gösterilen tabloda belirtilen sıcaklıkta üç dakika boyunca 300 G'de döndürün.

Daha sonra 200 mikrolitrelik bir pipet kullanarak, serbest lipitlerin üst tabakasını dikkatlice atın. Daha sonra, olgun adipositleri 10 mililitre büyüme ortamı içeren hazırlanmış 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için ucu kesilmiş bir P1000 pipeti kullanın. Olgun adipositler içeren 15 mililitrelik tüpleri, beyaz tabaka ortam boyunca dağılana kadar üç ila beş kez nazikçe ters çevirin.

Tüpleri 10 dakika dinlendirdikten sonra, katmanları daha da ayırmak için önceden belirlenen sıcaklıkta döndürün. Bundan sonra, serbest lipitlerin üst tabakasını atmak için bir pipet kullanın. Şimdi beş mililitrelik bir şırıngaya 21 gauge iğne takın ve iğnenin alt kısmı olgun adiposit bölge tabakasının altına gelene kadar iğneyi tüpün kenarından dikkatlice kaydırın.

Ardından, kültür ortamını ve hücresel kalıntıları çıkarmak için şırıngayı yavaşça yukarı çekin. Tüpe yavaşça 10 mililitre kültür ortamı ekleyin. Jel yükleme pipet uçlarını kullanma Olgun adiposit tabakasının altından kalan ortamı çıkarmak için ucu tüpün kenarından aşağı kaydırın.

Daha sonra hücreleri bir dakika boyunca 100 G'de santrifüjleyin. Bir pipet kullanarak serbest lipitleri çıkarın. Jel yüklemeli bir pipet ucu kullanarak, adipositlerin altındaki kültür ortamını çıkarın.

Hücre kültürü eklerini doku kültürü ile muamele edilmiş 24 oyuklu bir plakadan çıkarın ve bunları zar tarafı yukarı bakacak şekilde davlumbazın yüzeyine yerleştirin. Plakanın alternatif kuyularını ılık kültür ortamı ile doldurun. Kesilmiş bir P200 pipet ucu kullanarak, 30 mikrolitre paketlenmiş olgun adipositi bir Transwell ekinin üstüne aktarın.

Ardından Transwell ekini dikkatlice alın, ters çevirin ve 24 oyuklu plakada önceden doldurulmuş bir kuyuya yerleştirin. Ortamı kuyulardan çıkarmak için Transwell ekini sabit tutun ve yanlardaki küçük açıklıklardan bir P200 pipeti ile aspire edin. Ortamı çıkardıktan sonra, Transwell'i yerinde tutarken, kuyunun yan duvarı boyunca yavaşça bir mililitre taze ortam ekleyin.