Epidermal Keratinosit Proliferasyon Kinetiğini İncelemek için Zaman Atlamalı Fotoğrafçılık ile Canlı Hücre Görüntüleme

Bu araştırma, sedef hastalığı ve yaşlanma gibi hiper ve hipoproliferatif hastalıklara odaklanmakta olup, bu durumların kök hücre ve progenitör hücre çoğalmasını nasıl etkilediğine vurgu yapmaktadır. Proliferatif kusurların spesifik bölgelerinin belirlenmesi, daha hassas hedefli tedavilerin geliştirilmesini mümkün kılacaktır. İnsan epidermisi için, birçok nesil boyunca bağlı ataların izlenmesine olanak tanıyan tekniklerimiz yok.

Son olarak, canlı hücre görüntüleme, in vitro nesiller boyunca bağlı bir öncülünü takip etmemize olanak tanır ve insan adanmış ataların davranışına dair birçok içgörü sağlamıştır. Canlı hücre görüntüleme kullanarak, kök hücrelerin bağlı atalara göre daha az bölündüğünü bilsek de, bölündüklerinde daha hızlı bölündüklerini gösterdik. Doku hasarı oluştuğunda, kök hücreler hızlı bir dönüşümle yanıt verebilir.

Başlamak için, taze insan derisinden keratinositler alın. Analiz için uygun tohumlama yoğunluğunu belirleyin ve farklı bağışçılardan çoklu seyreltme örnekleri kullanarak pilot çalışmalar yapın. Hücrelerin eşit dağılımı sağlamak için, belirli bir seyreltme noktasında tüm kuyular için gereken toplam ortamı mikro tüpe aldırın.

İstenilen yoğunluğa ulaşmak için gereken toplam hücre sayısını aliquot'a pipet yapın ve mikro tüpü nazikçe ters çevirerek hücreleri homojen şekilde dağıtın. Şimdi, süspansiyonu plakalara ekleyin. Kaplamadan sonra, plakayı çapraz bir desenle üç kez yukarı, aşağı, sonra sol, sağa hareket ettirin ve tabağı dikkatlice kuluçka makinesine aktarın.

Kuluçkadan sonra medyayı değiştirin. Görüntüleme sisteminin kuluçka sistemini açmak için sol alt köşedeki büyük üçgen düğmeye basın. Işık yeşile döndüğünde, kabı açık bir bölmeye yerleştirin ve aynı düğmeyle tepsiyi kapatın.

Şimdi uygulamayı bilgisayarda açın ve uygun kullanıcı kimliği ve şifreyle giriş yapın. Sonra Schedule seçeneğini seç. Programın altındaki Plus butonuna basarak plakayı Program'a ekleyin.

Scan on Schedule'u seçin, ardından Sonra'ya tıklayın. Sonra Yeni seçeneğini seçin ve Tarama Tipi için Standard'ı seçin. Tarama Ayarları için, 10x Objective'deki faz kanalını kullanarak Hücre Hücre Yapışkan Hücre seçin ve ardından Sonra'ya tıklayın.

Sonra, Vessel'i seçin ve sonra Sonraki'ye tıklayın. Boş bir bölme seçin ve gemiyi yerleştirin, sonra Sonraki'ye tıklayın. Taranacak kuyuları ve her kuyu başına kaç görüntü sayısını seçin, ardından Sonra'ya tıklayın.

Deneye istenen adlandırma geleneğiyle adlandırın. Deneyin bir plaka haritasını oluştur, gelecekte referans alın. Sonra Tamam tuşuna tıklayın.

Şimdi devam etmek için Aşağı'ya tıklayın. Analiz veri toplandıktan sonra erteleyin; çünkü Hücre Hücre Analiz tarama sonrası başlatılmalıdır. Tekrar Sonraki'ye tıklayın.

Görüntüleme frekansını 20 dakikalık aralıklara ayarlayarak mitozu güvenilir şekilde takip edin ve bu durum yaklaşık her 30 dakikada bir gerçekleşir. Deneye başlamak için Aşağı'ya basın ve ayarları onaylayın. Keratinositler için her 48 saatte bir madde değiştirin.

Doğru plaka yönünü sağlamak için, her bir kap makineye yerleştirildiğinde ilk taramanın tamamlanmasını bekleyin. Plakayı, sıraları belirten harfler bölmenin sol tarafında olacak şekilde yerleştirin. Yetişkin kolonileri yaklaşık iki hafta, yenidoğan kolonilerini ise yaklaşık 10 gün takip edin; bu sırada kalabalık analitik kaliteyi azaltır.

Tüm kuyular hareketsiz hale geldiğinde veya birleşim noktasına ulaştığında, Görüntüle sekmesine tıklayın ve Son Dolandırıcılıklar listesi altında deneyi çift tıklayın. Oklu Yatay simgesine tıklayın ve Dışa Aktarma aracının açılmasını bekleyin. Görüntülendiği Gibi'ye tıklayın, sonra Sonraki'ye tıklayın.

Sonra her alana manuel olarak tıklayın ve ardından Sonraki'ye tıklayın. Bir film mi yoksa bir dizi görüntü mi istendiğini seçin. Keratinosit soy izi için Film seçeneğini seçin ve Herkesi Seç simgesi ile tüm taramaları seçin ve Sonraki'ye tıklayın.

Kalite yanındaki çubuğu ayarladıktan sonra maksimum kalitede saniyede bir kare hızında dışa aktarın. Hedef Klasör ve Dosya Türünü seçtikten sonra dosyaya isim verin ve Dışa Aktar'a tıklayın. Video dosyasını bir medya oynatıcı ile açın, videolarda kaydırarak büyüyen kolonileri belirleyin.

VLC ile takip edilecek koloninin ekran görüntüsünü alın ve etiketleyin. Bir günlük video kaydının sonunda veya ardından ilgi alanları belirleyin. Videoyu geri sarın ve koloni oluşturan hücreyi belirleyin.

Hücre bölünmek üzereyken videoyu durdurun, çünkü hücre yoğunlaşıyor gibi görünüyor. Sol alt köşede gösterilen zaman damgasını kaydedin. Bölümün ekran görüntüsünü alın ve koloniyle aynı etiketle.

Her bölümü elle çizilmiş bir çizgi diyagramı ile belgeleyin. Manuel soy ağacını, tablo renkleri nedeniyle Yeşil Sayfalar olarak adlandırılan veri sayfalarına dönüştürün. Son olarak, yeşil sayfaları kullanarak proliferatif ve farklılaşma bölünmelerinin oranlarını hesaplayın.

Kök hücre ve bağlı aday kolonilerini belirleyin ve hücre döngüsünün süresini belirleyin. Birincil keratinositler, ilk tohumlanmada küçük, yuvarlak hücreler olarak başlayan ve ardından yastılaşıp hareketli hale gelen stereotipik bir görünüm ilerlemesi göstermiştir. Bölünmeden önce yoğunlaşmaya başlar ve proliferatif koloniler veya terminal olarak farklılaşmış koloniler oluştururlar; bu koloniler uniform olmayan morfolojiye sahiptir.

Yeşil tabaka oluşturulduktan sonra, hangi koloninin kök hücrelerden, hangilerinin ise bağlı atalardan geldiği belirlenebilir.