Trombosit Alt Popülasyonlarının Çok Renkli Akış Sitometrisi ile Analiz Edilmesi

Araştırmamız, trombosit alt popülasyonlarını tanımlamak ve karakterize etmek için çok renkli akış sitometrisi kullanır ve tromboz, inflamasyon ve hastalığa özgü bağlamdaki rolleri, aktivasyon modellerini ve klinik önemi anlamayı amaçlar. Kurulan çok renkli akış sitometrik testi, bir trombosit agonistinin farklı bir aktivasyon paterni indüklemesini sağlar ve kollajen ile ilişkili peptit ile karşılaştırıldığında bir prokoagülan ve alt popülasyon oluşturur. Çok renkli test, tek bir tüpte izole edilmiş insan trombositlerinden oluşan bir popülasyon içinde tek bir trombositin trombosit aktivasyonu, adezyonu, agregasyonu ve apoptotik potansiyelinin aynı anda ölçülmesini sağlar.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, prosedür için gerekli tüm reaktifleri hazırlayın. Şimdi, 10 mililitre 10x Tyrode tamponunu 90 mililitre damıtılmış su ile karıştırın. 0.1 gram glikoz ekleyin ve tam hacmin pH'ını hepes ile 7.4'e ulaşacak şekilde ayarlayın. İlk olarak, tamponun 10 mililitresinin pH'ını 7.4'e ayarlayın ve ardından kalan 90 mililitrenin pH'ını bir normal hidroklorik asitle 6.5'e ayarlayın. Kan örneği toplanması için, her donör için iki mililitre ACD antikoagülan içeren 10 mililitrelik bir şırınga hazırlayın. Şırınganın oda sıcaklığında dengelenmesine izin verin. Donör kanını önceden ısıtılmış bir ACD şırıngasında topladıktan sonra, ACD ile tedavi edilen kanı yavaşça 15 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın. ACD ile muamele edilen kanı, mola kullanmadan oda sıcaklığında 20 dakika boyunca 209G'de santrifüjleyin. Bu arada, 50 mililitrelik bir reaksiyon tüpünde 25 mililitre Tyrode'un Hepes tamponu, pH 6.5 hazırlayın. Santrifüjlemeden sonra, üst trombositten zengin plazma tabakasını Tyrode'un Hepes tamponunu içeren tüpe nazikçe aktarın. Kontaminasyonu önlemek için, buffy coat ve eritrosit tabakasının üzerinde yaklaşık bir mililitre trombositten zengin plazma bırakın. Ardından, trombositleri peletlemek için süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 430G'de santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve trombosit peletini pH 7.4'e ayarlanmış 200 ila 300 mikrolitre Tyrode tamponunda dikkatlice yeniden süspanse edin. Trombosit sayısını, pH 7.4'te Tyrode'un Hepes tamponu ile mikrolitre başına 200.000 trombosit olarak ayarlamadan önce bir hücre sayacı kullanarak ölçün. CD61, CD42B, CD41, CXCR7 ve CXCR4 dahil olmak üzere boyamadan önce aktivasyon gerektirmeyen reseptörler için, antikor başına bir boyanmamış ve bir lekeli numune hazırlayın. PAC-1, CD63, CD62P, NXN5 ve zombi NIR gibi aktivasyon gerektiren reseptörler veya belirteçler için. Numuneyi mililitre CRPXL başına 10 mikrogram ile aktive edin ve hem aktif hem de aktif olmayan numuneleri hazırlayın. Trombositleri aktive etmek için, 30 dakika boyunca mililitre CRPXL başına 10 mikrogram ile inkübe edin. Daha sonra, izole edilmiş trombositi değişen konsantrasyonlarda florokrom konjuge antikor ile inkübe edin veya 30 dakika boyunca ölün. Ardından, seyreltmek için her numuneye 300 mikrolitre aneksin bağlama tamponu ekleyin. Bir akış sitometresi kullanarak her numune için 10.000 olayı ölçün. Pozitif ve negatif popülasyonlar arasındaki optimal ayrımı belirlemek için her antikor için leke indeksini hesaplayın. Her antikor için en uygun konsantrasyonu belirlemek için leke indeksini antikor konsantrasyonlarına karşı çizin Boyama için, 3M'lik bir çözelti oluşturmak için hemen tozu 1.4M Sodyum Hidroksit içinde çözün. Çözeltiyi dakikada 450 devirde beş dakika boyunca 96 santigrat dereceye ısıtın. Üç milimolar sap çözeltisi elde etmek için damıtılmış su ile seyreltin. Trombosit sayısını numune başına 1 milyon trombosit olarak ayarladıktan sonra, trombositleri daha önce gösterildiği gibi etkinleştirin. Her örneğe 43.3 mikrolitre antikor kokteyli ekleyin ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir numuneyi pH 7.4'te 10 milimolar Hepes Sodyum Hidroksitten oluşan bağlayıcı tamponda 300 mikrolitre bir X ve X ile seyreltin. Akış sitometresini kullanarak lekeli her numuneyi hemen ölçün. Boncuklarla telafi için, her florofor için 150 mikrolitre PBS hazırlayın ve bir damla boncuk ve bir mikrolitre floresan konjuge antikor ekleyin. Ek V'yi telafi etmek için, ek V ile aynı florofora konjuge edilmiş anti-insan CD 62L ile etiketlenmiş PECY7B yedi boncuk kullanın. 150 mikrolitre PBS'de iki damla pozitif boncuk ve bir damla negatif boncuk bir mikrolitre kalıpla karıştırarak Amin reaktif boya için amin reaktif dengeleme boncukları kullanın. Pozitif boncukların tepki verdiğini ve bir sinyal gösterdiğini ve negatif boncukların tepki vermediğini onaylayın. Her işaretleyici için bir floresan eksi bir kontrol hazırlayın. Dağılım grafikleri, trombosit popülasyonunda net bir kayma gösterdi. Hemin, diğer agonistlere göre düşük öne saçılma ile daha fazla trombosit oluşturur. ADP trombin ve CRPXL ile tedavi, trombositlerin %40 ila 60'ının CD42 pozitif olmasına neden olurken, hemin bu popülasyonu önemli ölçüde azalttı. Tüm trombosit agonistlerinin CD41 ve CD61 yüzey ekspresyonu üzerinde etkisi yoktu. CXCR4 ve CXCR7 yüzey ifadesini yalnızca hemen önemli ölçüde artırdı. Ek olarak, fosfatidilserin maruziyeti de hemin tedavisi altında arttırıldı ve bu da annexin V pozitif hücrelerin artmasına neden oldu. UMAP ve fenol grafik analizleri, agonist tipine göre değişen 27 farklı trombosit kümesi tanımladı. Hemin, küme modellerinde en dramatik değişime neden oldu. Dinlenme trombosit alt popülasyonları en çok ADP ile korunmuş ve hemin ile kiralanmıştır.