Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogaster'de Locus'a Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti

Araştırmamız, hücrelerin genomlarındaki çoklu ribozomal DNA lokuslarını nasıl algıladığını, izlediğini ve düzenlediğini anlamaya odaklanmaktadır. Spesifik olarak, hangi rDNA lokuslarının aktif olarak kopyalandığını ve bu lokusların ayrı ayrı nasıl düzenlendiğini ayırt eden mekanizmaları ortaya çıkarmayı amaçlıyoruz. Son zamanlarda, bir hücredeki rDNA miktarının zamanla değişebileceğini ve bu değişikliğin hangi rDNA lokuslarının kopyalandığını değiştirdiğini bulduk.

Artık hücrelerin, sahip oldukları rDNA miktarına bağlı olarak rDNA transkripsiyonlarını değiştireceklerini anlıyoruz. Bu keşif, hücrelerin ne kadar RDA'ya sahip olduklarını nasıl bildiklerini ve hangi rDNA lokusunu ifade etmeyi tercih edeceklerini nasıl belirlediklerini sormamıza neden oluyor. Laboratuvarımız şimdi hücrelerin farklı rDNA lokuslarını ayırt etmek ve aktivitelerini algılamak ve düzenlemek için kullandıkları mekanizmayı anlamaya odaklanmıştır.

Stereomikroskop altında, RNaz içermeyen PBS'de testisleri izole etmek için Drosophila'yı inceleyin. Başlamak için, hayvanı nazikçe ayırmak için karnın ortasını bir çift forseps ile ve karnın ucunu başka bir çiftle kavrayın. Forseps kullanarak, izole edilmiş testisleri diseksiyon kabından 0.5 mililitre RNaz içermeyen PBS içeren 1.5 mililitrelik bir mikrofüj tüpüne aktarın.

PBS'yi aspire edin ve bir mililitre fiksasyon çözeltisi ekleyin. Numuneyi 30 dakika boyunca oda sıcaklığında bir somun çalkalayıcı üzerine yerleştirin. İnkübasyondan sonra, fiksasyon çözeltisini aspire edin.

Daha sonra numuneyi bir mililitre PBS ile her biri beş dakika boyunca iki kez fındıklı bir çalkalayıcı üzerinde yıkayın. PBS'yi aspire ettikten sonra, bir mililitre RNaz içermeyen% 70 etanol ekleyin ve numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede bir nutating çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Daha sonra, etanolü aspire edin ve numuneye bir mililitre yıkama tamponu ekleyin.

Numuneyi oda sıcaklığında bir nutating çalkalayıcı üzerinde üç dakika inkübe edin. Bundan sonra, tüpün iki dakika boyunca dik olarak dinlenmesine izin verin. Burada gösterildiği gibi numune başına toplam 100 mikrolitrelik bir hacim hazırlamak için probları ve maskeleri hibridizasyon tamponu ile karıştırın.

Ardından, yıkama tamponunu aspire ettikten sonra numuneye 100 mikrolitre hibridizasyon çözeltisi ekleyin. Tüpün kenarlarını kapatmak için şeffaf bir film uygulayın. Tüpü ışıktan korumak için alüminyum folyoya sarın ve numuneyi en az 24 saat boyunca 37 santigrat derece su banyosunda inkübe edin.

Hibridizasyon çözeltisini aspire etmeden, numuneye bir mililitre yıkama tamponu ekleyin. Numuneyi karanlıkta 30 dakika boyunca 37 santigrat derece su banyosunda inkübe edin. Yıkama tamponu aspire edildikten sonra, numuneye bir mililitre taze yıkama tamponu ekleyin ve tekrar inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, yıkama tamponunu aspire edin ve numuneye 50 mikrolitre montaj ortamı ekleyin. Diseksiyon stereomikroskobu altında, numuneyi bir mikroskop lamına aktarmak için bir pipet kullanın. Forseps kullanarak, görüntüleme sırasında numunenin tanımlanmasını kolaylaştırmak için testisleri mikroskop lamı üzerinde bir çizgi halinde düzenleyin.

Numuneyi bir kapak mendili ile örtün ve fazla montaj ortamını çıkarmak için kapak mendilinin kenarlarını bir mendil ile kurulayın. Kapak kağıdının kenarlarını oje ile kapatın ve ojenin kuruması için oda sıcaklığında 10 dakika karanlıkta bırakın. rRNA sinyalleri, özellikle büyük çekirdekli ve nükleollü germ hücrelerinde, çekirdek içinde DAPI gözenek bölgeleri olarak görünen nükleolde tespit edildi.

rRNA lokusları olmayan örneklerde sitoplazmada soluk, spesifik olmayan sinyaller gözlendi. Çoğu hücrede, YrRNA sinyalleri özel olarak tespit edildi, bu da YrDNA lokusundan rRNA transkripsiyonunu gösterir. X ve YrRNA'nın birlikte ekspresyonu, germ hücrelerinde gözlendi, sinyaller ya tek bir çekirdeğe birleşti ya da iki nükleole ayrıldı.