Name: Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogasterde Locusa Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Keşfedin, Drosophila melanogaster'de SNP-FISH yöntemiyle X ve Y kromozomlarındaki ribozomal DNA lokuslarından gelen rRNA transkripsiyonlarını nasıl ayırt edebileceğinizi. Bu teknik, hücrelerin rDNA transkripsiyonunu düzenleme mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Baßler, J., Hurt, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eurokaryotic+ribosome+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Eurokaryotic ribosome assembly.</a> Ann Rev Biochem. 88 (1), 1-26 (2018).</li>
<li>Hall, A. N., Morton, E., Queitsch, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+discovered%2C+long+out+of+sight%2C+finally+visible%3A+ribosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Genet%22%5BJournal%5D)">First discovered, long out of sight, finally visible: ribosomal DNA.</a> Trend Genet. 38 (6), 587-597 (2022).</li>
<li>Srivastava, R., Srivastava, R., Ahn, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+epigenetic+pathways+to+ribosomal+DNA+silencing%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Mol+Biol+Rev%22%5BJournal%5D)">The epigenetic pathways to ribosomal DNA silencing.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 80 (3), 545-563 (2016).</li>
<li>Kuo, B. A., Gonzalez, I. L., Gillespie, D. A., Sylvester, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+ribosomal+RNA+variants+from+a+single+individual+and+their+expression+in+different+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">Human ribosomal RNA variants from a single individual and their expression in different tissues.</a> Nucl Acid Res. 24 (23), 4817-4824 (1996).</li>
<li>Tseng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+ribosomal+RNA+genes+contain+multiple+differentially+regulated+variants%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mouse ribosomal RNA genes contain multiple differentially regulated variants.</a> PLoS ONE. 3 (3), e1843(2008).</li>
<li>Locati, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+distinct+maternal+and+somatic+5.8S%2C+18S%2C+and+28S+rRNA+types+during+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Expression of distinct maternal and somatic 5.8S, 18S, and 28S rRNA types during zebrafish development.</a> RNA. 23 (8), 1188-1199 (2017).</li>
<li>Roussel, P., André, C., Comai, L., Hernandez-Verdun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rDNA+transcription+machinery+is+assembled+during+mitosis+in+active+NORs+and+absent+in+inactive+NORs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The rDNA transcription machinery is assembled during mitosis in active NORs and absent in inactive NORs.</a> J Cell Biol. 133 (2), 235-246 (1996).</li>
<li>Pontes, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postembryonic+establishment+of+megabase-scale+gene+silencing+in+nucleolar+dominance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Postembryonic establishment of megabase-scale gene silencing in nucleolar dominance.</a> PLoS ONE. 2 (11), e1157(2007).</li>
<li>Earley, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+HDA6-mediated+rRNA+gene+silencing%3A+suppression+of+intergenic+Pol+II+transcription+and+differential+effects+on+maintenance+versus+siRNA-directed+cytosine+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Dev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of HDA6-mediated rRNA gene silencing: suppression of intergenic Pol II transcription and differential effects on maintenance versus siRNA-directed cytosine methylation.</a> Gene Dev. 24 (11), 1119-1132 (2010).</li>
<li>Greil, F., Ahmad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+dominance+of+the+Y+chromosome+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nucleolar dominance of the Y chromosome in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 191 (4), 1119-1128 (2012).</li>
<li>Preuss, S., Pikaard, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rRNA+gene+silencing+and+nucleolar+dominance%3A+Insights+into+a+chromosome-scale+epigenetic+on%2Foff+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">rRNA gene silencing and nucleolar dominance: Insights into a chromosome-scale epigenetic on/off switch.</a> Biochim Biophys Acta. 1769 (5-6), 383-392 (2007).</li>
<li>Sharifi, S., Bierhoff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RNA+pPolymerase+I+transcription+in+development%2C+disease%2C+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Regulation of RNA pPolymerase I transcription in development, disease, and aging.</a> Ann Rev Biochem. 87 (1), 1-23 (2018).</li>
<li>Lu, K. L., Nelson, J. O., Watase, G. J., Warsinger-Pepe, N., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenerational+dynamics+of+rDNA+copy+number+in+Drosophila+male+germline+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Transgenerational dynamics of rDNA copy number in Drosophila male germline stem cells.</a> eLife. 7, e32421(2018).</li>
<li>Nurk, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+complete+sequence+of+a+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The complete sequence of a human genome.</a> Science. 376 (6588), 44-53 (2022).</li>
<li>Ritossa, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unstable+redundancy+of+genes+for+ribosomal+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Unstable redundancy of genes for ribosomal RNA.</a> Proc Natl Acad Sci. 60 (2), 509-516 (1968).</li>
<li>Nelson, J. O., Slicko, A., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+retrotransposon+R2+maintains+Drosophila+ribosomal+DNA+repeats%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">The retrotransposon R2 maintains Drosophila ribosomal DNA repeats.</a> Proc Natl Acad Sci. 120 (23), e2221613120(2023).</li>
<li>Warsinger-Pepe, N., Li, D., Yamashita, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+nucleolar+dominance+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of nucleolar dominance in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 214 (4), (2020).</li>
<li>Levesque, M. J., Ginart, P., Wei, Y., Raj, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+SNVs+to+quantify+allele-specific+expression+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Visualizing SNVs to quantify allele-specific expression in single cells.</a> Nat Meth. 10 (9), 865-867 (2013).</li>
<li>Davis, M. W., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ApE%2C+a+plasmid+editor%3A+A+freely+available+DNA+manipulation+and+visualization+program%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioinfo%22%5BJournal%5D)">ApE, a plasmid editor: A freely available DNA manipulation and visualization program.</a> Front Bioinfo. 2, 818619(2022).</li>
<li>Qazi, M. C. B., Heifetz, Y., Wolfner, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+developments+between+gametogenesis+and+fertilization%3A+ovulation+and+female+sperm+storage+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The developments between gametogenesis and fertilization: ovulation and female sperm storage in Drosophila melanogaster.</a> Dev Biol. 256 (2), 195-211 (2003).</li>
<li>Rogers, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+features+of+the+large+subunit+rRNA+expressed+in+Plasmodium+falciparum+sporozoites+that+distinguish+it+from+the+asexually+expressed+subunit+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Structural features of the large subunit rRNA expressed in Plasmodium falciparum sporozoites that distinguish it from the asexually expressed subunit rRNA.</a> RNA. 2 (2), 134-145 (1996).</li>
<li>Potapova, T., et al. Epigenetic control and inheritance of rDNA arrays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPotapova%2C+T+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Tang, Y. Z., Gin, K. Y. H., Lim, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-temperature+fluorescent+in+situ+hybridization+for+detecting+Escherichia+coli+in+seawater+samples%2C+using+rRNA-targeted+oligonucleotide+probes+and+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">High-temperature fluorescent in situ hybridization for detecting Escherichia coli in seawater samples, using rRNA-targeted oligonucleotide probes and flow cytometry.</a> Appl Environ Microbiol. 71 (12), 8157-8164 (2005).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>PTC Tempo 96 Termal Döngüleyici</td><td>Bio Rad 12015382</td><td></td><td>Herhangi bir termal döngüleyici</td></tr> kullanılabilir <tr><td>0,2 mL 8 şerit düz kapaklı PCR tüpleri</td><td>VWR</td><td>89133-912</td><td>Herhangi bir uyumlu tüp kullanılabilir</td></tr><tr><td>1 kb DNA merdiveni</td><td>NEB</td><td>N3232S</td><td>Sekanslamayı kontrol ederken kullanmak için Jel elektroforezi ile PCR amplikon boyutu</td></tr><tr><td>1,5 mL dereceli mikrosantrifüj tüpleri</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5510</td><td>Herhangi bir sertifikalı RNase içermeyen tüp,</td></tr><tr><td>2 mM dNTP Karışımı</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0241</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Tampon</td><td>Bio Rad</td><td>1610743</td><td>Jel elektroforezi için kullanılır. Herhangi bir TAE tamponu kullanılabilir.</td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Herhangi bir NaCl</td><td></td><td></td> kullanılabilir veya herhangi bir kaynaktan hazırlanabilir</tr><tr><td>Agarose</td><td>VWR</td><td>97064-250</td><td>Herhangi bir Agaroz kullanılabilir</td></tr><tr><td>ApE - Bir plazmid Düzenleyici yazılım</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> <tr><td>https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ Şeffaf oje</td><td></td><td></td><td>Herhangi bir perakendeciden alınan herhangi bir oje kullanılabilir</td></tr><tr><td>Kapak camı, No. 1 Kalınlık</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A38</td><td></td></tr><tr><td>Deiyonize Formamid</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9569627</td><td></td></tr><tr><td>Dekstran Sülfat Sodyum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8906-10G</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Yeşil PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 forseps</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11252-20</td><td>Numuneleri incelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>EDTA (0.5M), Ph 8.0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1021</td><td>Karşılaştırılabilir herhangi bir ürün kullanılabilir</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td>Herhangi bir 200 geçirmez Etanol kullanılabilir. Rnaz içermeyen koşullar için geçirgenleştirme ve temizleme için% 70 etanole seyreltme için kullanılır</td></tr><tr><td>Etidyum Bromür</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Yatay Mini Jel Elektroforez Sistemi</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-170</td><td>Herhangi bir jel elektroforez sistemi kullanılabilir</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Mikro Test Boyama Kabı Elektronu</td><td> Mikroskopi Bilimleri</td><td>71564</td><td>Numuneleri incelemek için kullanılır</td></tr><tr><td>Nutating çalkalayıcı</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BMSB3D1020</td><td>Herhangi bir somunlama çalkalayıcı kullanılabilir</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>USA Scientific</td><td>3023-4526</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (10X) pH 7.4, RNaz İçermeyen</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Pierce %16 Formaldehit (a/h), Metanol İçermeyen</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Hassas Genel Amaçlı Su Banyosu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>TSGP02</td><td>Herhangi bir su banyosu kullanılabilir</td></tr><tr><td>QIAquick Jel Ekstraksiyon Kiti</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Herhangi bir jel ekstraksiyon kiti kullanılabilir</td></tr><tr><td>Rekombinant Proteinaz K Çözeltisi (20 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2546</td><td>Karşılaştırılabilir herhangi bir ürün kullanılabilir</td></tr><tr><td>Rnaz içermeyen UltraPure BSA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae tRNA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8759</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X), RNaz içermeyen</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A16046.AE</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 1M Tris-HCl Tampon, pH 7.5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td><td>Karşılaştırılabilir herhangi bir ürün kullanılabilir</td></tr><tr><td>Vanadil ribonükleozit</td><td></td> kompleksi NEB S1402S <td></td> VECTASHIELD montaj ortamı 10977023 <td></td>UltraPure DNase/RNase İçermeyen Damıtılmış Su Ömrü</tr><tr><td></td><td></td><td></td> Teknolojileri DAPI Vector Laboratories H-1200-10 VWR Superfrost Mikroskop Slaytı VWR 48311-601 y[1]w[1] Drosophila melanogaster hattı <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bloomington Drosophila Stok Merkezi</td><td>1495</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss LSM 980 konfokal mikroskop</td><td>Zeiss mikroskobu</td><td></td><td>Uyumlu emisyon ve algılamaya sahip herhangi bir konfokal mikroskop kullanılabilir</td></tr><tr><td>Zeiss Stemi 2000-C Stereo Mikroskop ve ışık kaynaklı</td><td>Mikroskop Merkezi</td><td>455053</td><td>Herhangi bir steromikroskop kullanılabilir</td></tr></tbody></table>

tek nükleotid polimorfizmine duyarlı fish drosophila melanogaster'de locus'a Özgü ribozomal rna transkripsiyonunun tespiti

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

SNP genotiplemesinden elde edilen dizileme sonuçlarının, X ve Y rDNA lokusları arasındaki SNP farklılıklarını tespit etmesi beklenmektedir. Bu SNP'ler, sıralama kromatogramlarındaki SNP pozisyonlarının doğrudan değerlendirilmesiyle tespit edilir (Şekil 2). Dişi örneklerin diziliminin, SNP pozisyonunda, iki X kromozomu arasındaki SNP homozigotluğunu gösteren tek bir dizileme sinyaline sahip olması beklenir (Şekil 2A). Erkek numune dizileme sonuçlarının SNP pozisyonunda çift tepe noktasına sahip olması beklenmektedir (Şekil 2B). Dişi numune diziliminden belirlenen X kromozomu genotipine dayanarak, X olmayan varyantın bir Y kromozomu rDNA SNP olduğu sonucuna varılır (yani, Şekil 2'deki 18S SNP dizilimi için X = T, Y = C). Alternatif olarak, erkek numunede bir SNP pozisyonunda tek bir dizileme zirvesi, o SNP pozisyonunda erkek ve dişi rDNA lokusları arasındaki homozigotluğu gösterir ve bu pozisyon rRNA SNP-FISH için kullanılamaz.
SNP FISH protokolünü takiben, numuneler slaytlara monte edilerek görselleştirilebilir ve kapalı bir örtü kızağı altına yerleştirilebilir, ardından konfokal mikroskopi uygulanabilir. Tablo 3'te listelenen problar kullanılarak, Y'den türetilen rRNA sinyali Alexa Fluor 647 emisyonu ile tespit edilir ve X'ten türetilen rRNA sinyali Alexa Fluor 488 emisyonu ile tespit edilir. rRNA sinyallerinin çekirdekte gözlenmesi beklenir, bu da çekirdekteki DAPI açısından fakir delik olarak tanımlanabilir (Şekil 3A). Nükleolus, büyük çekirdekleri ve çekirdekçikleri nedeniyle germ hücrelerinde tanımlanması özellikle kolaydır (Şekil 3A). Zayıf sinyal tipik olarak sitoplazmada da bulunabilir (Şekil 3), ancak bu, tamamlayıcı bir SNP içeren rRNA'sı olmayan örneklerde de tespit edilebilen spesifik olmayan bir sinyaldir (yani, Y rDNA'sı olmayan hücrelerde Y sinyali veya X rDNA'sı olmayan hücrelerde X sinyali; Şekil 3B-C). Ayrıca, X ve Y rRNA'nın yapay olarak birlikte etiketlenmesi, X veya Y rDNA lokusları olmayan örneklerde bile bazen somatik merkezde tespit edilebilir (Şekil 3B-C, sarı oklar). Bu nedenle, lokusa özgü transkripsiyonu değerlendirmek için yalnızca nükleer sinyaller kullanılmalıdır. Çoğu hücrenin, özellikle somatik hücrelerin, yalnızca bir Y rRNA sinyaline sahip olması beklenir, bu da rRNA'nın yalnızca Y rDNA lokusundan kopyalandığını gösterir (Şekil 3A, sarı noktalı daire ve kırmızı ok)10,17. Bununla birlikte, X ve Y rRNA'nın birlikte ekspresyonu sıklıkla germ hücrelerinde, özellikle germ hattı kök hücrelerinde13 tespit edilir (Şekil 3A, beyaz noktalı daireler). Birlikte eksprese eden hücrelerdeki X ve Y rRNA sinyalleri bitişik olabilir ve tek bir nükleol oluşturabilir (Şekil 3A üst hücre) veya iki nükleol oluşturarak ayrı olabilir (Şekil 3A alt hücre). Şekil 3'teki örnekler, yalnızca iki SNP'yi (iki ITS1 SNP) hedefleyen prob setleri kullanılarak rDNA SNP-FISH'ten sağlanmıştır ve rDNA SNP-FISH için yalnızca iki SNP'nin gerekli olduğunu göstermektedir. Bununla birlikte, dört SNP'nin tümünü hedefleyen problar kullanılırken daha sağlam sinyaller gözlenir13.
Negatif kontroller, özellikle yöntemde ilk sorun giderme sırasında, probların yanlış SNP hedefiyle çapraz reaksiyona girmediğini doğrulamak için bu test için önemli bir katılımdır. X kromozomu negatif kontrolleri, rDNA delesyonu olan bir X kromozomu barındıran erkekler gibi, X kromozomu rDNA'sı olmayan herhangi bir durumu içerir. X kromozomu negatif kontrollerinin sadece Y rRNA sinyalini algılaması ve X rRNA'yı algılamaması beklenir (Şekil 3B). Y kromozomu negatif kontrolleri, Y kromozomu rDNA'sı olmayan herhangi bir durumu içerir. Bu koşulların bazı örnekleri, herhangi bir XX dişi dokusu, Y kromozomu olmayan erkeklerden alınan doku veya rDNA delesyonu15 olan bir Y kromozomu barındıran erkeklerdir. Y kromozomu negatif kontrollerinin yalnızca X rRNA sinyalini algılaması ve saptanabilir bir Y rRNA sinyaline sahip olmaması beklenir (Şekil 3C). Bu kontrollerin yalnızca prob özgüllüğünü belirlemek için değil, aynı zamanda herhangi bir sinyal arka planını veya artefaktını belirlemek için de önemli olduğunu unutmayın. Bu tür kontrollerde özgüllük sağlayan herhangi bir yeni prob veya tahlil koşulu, lokusa özgü rDNA transkripsiyonunu tespit etmek için doğru bir şekilde kullanılabilir.
Farklı genetik, gelişimsel veya çevresel koşullar, rDNA'nın yalnızca Y kromozomu rDNA lokusundan13,17 kopyalanma olasılığını değiştirebilir. Tek bir lokustan veya birden fazla lokustan rDNA transkripsiyonunun sıklığı ölçülebilir ve numuneler arasında doğrudan karşılaştırılabilir. rDNA lokus transkripsiyonundaki farklılıkları kantitatif olarak karşılaştırmak için, her hücre ayrı ayrı Y-baskın, Ko-baskın veya X-baskın olarak kategorize edilmelidir. Hücreler, yalnızca ilgili sinyal algılanırsa Y ve X baskın olarak kategorize edilir. Hem Y hem de X rRNA sinyallerine sahip herhangi bir hücre, bir sinyal diğerinden çok daha zayıf olsa bile, eş baskın olarak kabul edilir. Bu nedenle, çok güçlü X ve Y sinyalleri içeren hücreler, niteliksel olarak güçlü Y ve zayıf X veya güçlü X ve zayıf Y sinyallerine sahip hücrelerle aynı kabul edilir. Her kategorideki tüm örneklerdeki tüm hücrelerin toplam yüzdesi, ki-kare testi ile örnekler arasında karşılaştırılabilir. Bu tahlil, belirli bir rDNA lokusunun kopyalanıp kopyalanmadığını kalitatif olarak belirlemek için iyi çalışsa da, bireysel SNP-FISH sinyallerinin floresan yoğunluğunu doğrudan ölçerken numuneler arasında tutarlı değerlendirmeler gözlemlemedik. Bu nedenle, numuneler arasındaki FISH sinyal yoğunluğunun veya tek bir hücre içindeki X ve Y rDNA sinyallerinin nispi yoğunluğunun kantitatif değerlendirmelerinin yapılmasını önermiyoruz. Floresan yoğunluğundaki bu tutarsızlığın kaynağı belirsizdir, ancak bu, hedef rRNA'ların tümüne bağlanmayan maskelenmiş probların verimsiz bağlanmasından kaynaklanıyor olabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig01.jpg"> 
Şekil 1: SNP-FISH yönteminin diyagramı. (A) Geleneksel FISH antisens oligonükleotid probları, yalnızca bir nükleotid ile farklılık gösteren hedef olmayan RNA'larla çapraz reaksiyona girer. (B) SNP-FISH yöntemi, oligonükleotid probunun 3' bölgesine bağlı tamamlayıcı maske oligonükleotidi kullanır. Maske, hedef diziye bağlanmak için sadece 10 nükleotidi serbest bırakır. Maskelenmemiş bir prob bölgesi, bir veya daha fazla nükleotid tarafından farklılık gösteren hedef olmayan dizilere kararlı bir şekilde bağlanmaz. Maske, prob hedefe bağlandıktan sonra probdan ayrışır ve prob ile hedef arasında kararlı bir bağlanmaya izin verir. (C) Ortak bir maske ile birleştirilen farklı etiketlenmiş eşleştirilmiş SNP probları, çapraz reaksiyona girmeden tek bir nükleotid ile farklılık gösteren hedefleri özel olarak bağlar. (D) Farklı rRNA haplotiplerini spesifik olarak etiketlemek için birden fazla prob bir araya getirilebilir. Y1w1 Drosophila melanogaster suşunda X ve Y rDNA lokusları arasında dört SNP farkı karakterize edilmiştir. 18S rRNA'da bir SNP, 28S rRNA'da bir ve pre-rRNA'nın ITS1 kısmında iki SNP. SNP-FISH için kullanılan X ve Y'ye özgü rRNA haplotipleri görüntülenir. Dört rRNA SNP'de X rDNA varyantını hedefleyen problar, ortak bir florofora (yeşil) konjuge edilir ve Y rDNA varyantlarını hedefleyen problar, farklı bir florofora (macenta) konjuge edilir. Her SNP için ortak bir maske kullanılır (toplam dört). rRNA üzerindeki her SNP pozisyonunda SNP'ye özgü prob bağlanması, dört adede kadar FISH oligonükleotid probu ile X ve Y rDNA lokuslarından rRNA'yı spesifik olarak etiketleyebilir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig02.jpg"> 
Şekil 2: Homozigot ve heterozigot rDNA SNP dizileme sonuçlarına örnekler. Örnek dizileme kromatogramları: (A) dişi ve (B) erkek örneklerden alınan DNA'nın 18S SNP dizilimi. 18S SNP konumu yıldız (*) ile gösterilir. Dişi numunedeki SNP pozisyonu için tek timin (T) sinyali, X kromozomu rDNA lokusundaki SNP pozisyonunda bir timin olduğunu gösterir. Erkek numunede timin ve sitozin (C) arasında bölünen SNP pozisyonundaki çift sinyal, Y kromozomu rDNA lokusunda SNP pozisyonunda bir sitozini gösterir (timinin X kromozom lokusunda olduğunu bilerek çıkarım). Sıralama sonuçları, bir plazmid düzenleyici yazılımı olan ApE kullanılarak görüntülendi19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig03.jpg"> 
Şekil 3: SNP-FISH örnekleri, sadece iki SNP-FISH prob seti kullanılarak Drosophila testisinde sonuçlanır. (A) hem X hem de Y rDNA'sı, (B) sadece Y rDNA'sı veya (C) sadece X rDNA'sı olan hayvanların testislerinde SNP FISH örnekleri. Bu örneklerde yalnızca iki ITS1 rRNA SNP'yi etiketleyen prob setleri kullanıldı ve bu da rRNA SNP FISH'in en az iki hedef SNP ile çalıştığını gösterdi. Germ hücreleri büyük yuvarlak çekirdekleri ile ve somatik hücreler daha küçük ve daha az yuvarlak çekirdekleri ile tanımlanır. Germ hattı kök hücreleri, bir yıldız işareti (*) ile işaretlenmiş somatik merkezin hemen yanındaki konumlarıyla tanımlanır. Hem X hem de Y rDNA lokuslarından rDNA'yı kopyalayan germ hücreleri, hem X hem de Y nükleer FISH sinyalleri (Beyaz noktalı daireler, A-A'') ile tanımlanır. DNA'yı yalnızca Y rDNA lokusundan kopyalayan germ hücreleri yalnızca bir Y nükleer FISH sinyaline (Sarı noktalı daire) sahiptir. Yalnızca Y ifade eden somatik hücreler kırmızı bir okla işaretlenmiştir. X ve Y rDNA lokuslarının yapay olarak birlikte etiketlenmesi somatik merkezde (sarı ok) gözlemlenebilir. Ölçek çubuğu 10 μm'dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Dosya 1: X kromozom lokusunun rRNA dizisi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/Dm_45S_rRNA.zip" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogaster'de Locus'a Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

single-nucleotide-polymorphism-sensitive-fish-detection-locus

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Biz doğrudan etiketli floresan problar kullanarak 3D DNA FISH ile nükleer mimarisi analiz için sağlam ve çok yönlü protokol açıklar.

Doğrudan Etiketli Problar kullanarak Sağlam 3D DNA BALIK

Yüksek çözünürlüklü erime analizi (HRMA) ile bir araya PCR zebrafish genotip için hızlı ve etkili bir yöntem olarak gösterilmiştir.

Yüksek çözünürlüklü Melt Analizi ile PCR kullanarak hızlı ve verimli Zebra Genotiplemesi

Bu yayının amacı, görselleştirmek ve Drosophila çıkarılan RNA bir Geliştirilmiş Northern Blot protokolünün ameliyat adımları görüşmek embriyolar, hücreleri ve dokuları melanogaster etmektir. Bu protokol küçük RNA türünün etkin tespiti için özellikle yararlıdır.

Küçük RNA Türlerin Northern Blot Algılama geliştirilmiş Drosophila melanogaster

Ribozom Afinite Saflaştırması (TRAP) çevirisi, mRNA'nın hücre tipine özgü translasyonunu yakalayabilir. Burada, Drosophila embriyolarının nadir hücre popülasyonlarında mRNA'nın izolasyonuna adanmış ilk TRAP protokolünü rapor ediyoruz.

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH), belirli RNA'ların seviyelerini ve lokalizasyonunu tek hücre düzeyinde doğru bir şekilde ölçmek için bir yöntemdir. Burada, belirli RNA'ların tek hücreli nicelleştirilmesi için ıslak tezgah işleme, görüntüleme ve görüntü analizi için onaylanmış laboratuvar protokollerimizi rapor ediyoruz.

Transkripsiyonel Aktif Alellerin Tek Molekül FISH ile Tek Hücre Analizi

Burada, başarılı genetik modifikasyonların işaretsiz tanımlanması için PCR tabanlı bir teknik kullanan ve stabil knock-in hatlarının geliştirilmesini kolaylaştıran Drosophila için basitleştirilmiş bir endojen gen etiketleme protokolü sunuyoruz.

Drosophila melanogaster'de Endojen Gen Etiketleme için Tek Adımlı CRISPR Tabanlı Strateji

Drosophila, miyogenezi düzenleyen anahtar molekülleri incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler, mRNA transkripsiyonel dinamiklerini ve sinsitya içindeki uzamsal dağılımı belirlemek için yetersizdir. Bu sınırlamayı ele almak için, mRNA'ların tek molekül ölçeğinde saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini optimize ettik.

Drosophila'da Tek Moleküllü Ölçeklerde Kas Transkripsiyon Dinamiğinin İncelenmesi

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon (EASI-FISH), kalın dokuda birden fazla genin ekspresyonunu tespit etmek için genleşme mikroskobunu floresan in situ hibridizasyon (FISH) ile birleştiren sağlam bir tekniktir. Bu protokol, yöntemdeki son gelişmeleri ve bozulmamış Drosophila merkezi sinir sistemini etiketlemek için adaptasyonunu özetlemektedir.

Genişleme Destekli Yinelemeli Floresan In Situ Hibridizasyon Kullanılarak Sağlam Drosophila Beyindeki Gen Ekspresyonunun Multipleks Tespiti

Keşfedin, Drosophila melanogaster'de SNP-FISH yöntemiyle X ve Y kromozomlarındaki ribozomal DNA lokuslarından gelen rRNA transkripsiyonlarını nasıl ayırt edebileceğinizi. Bu teknik, hücrelerin rDNA transkripsiyonunu düzenleme mekanizmalarını anlamanıza yardımcı olur.

Tek Nükleotid Polimorfizmine Duyarlı FISH Drosophila melanogaster'de Locus'a Özgü Ribozomal RNA Transkripsiyonunun Tespiti

Daha fazla video keşfet