Bakterilerde Bakır Nanopartikül Kaynaklı Programlanmış Hücre Ölümünün İncelenmesi

Bu araştırma, bakırın klinik olarak anlamlı üç yaygın bakteriye karşı nanopartik bakterisidal etkinliğini araştırmaktadır. ROS üretimi ve potansiyel programlanmış hücre ölümü katılımı dahil olmak üzere vakaları araştırır.

Mevcut zorluklardan biri, tutarlı koloni sayımları elde etmektir. Bunun müdahaleden kaynaklandığına inanıyorum. Seyreltme sırasında hücre modernizasyonu, daha deneyimli sayıma kıyasla konumla sahte sayımdan kaynaklanır.

Grubumuz, bakır nanopartikül bakterisidal mekanizmalarını incelemek için bir hücre modülatörü kullanan ilk kişiydi ve bakteriyel ölümün ROS üretimi ve otofaji gibi hücresel süreçleri içerdiğini ortaya koydu.

Protokol, bakır nanopartiküllerin bakterileri öldürdüğü mekanizmanın daha derin bir şekilde anlaşılmasına duyulan ihtiyacı ele alıyor ve özellikle bakteriyel programlanmış hücre ölüm yollarının keşfedilmemiş alanına odaklanıyor.

Farklı hücre modülatörleri kullanarak, bakır nanopartikül kaynaklı bakteri ölümünün otofaji ve ROS aşırı yüklenmesini içerdiğini doğruladık ve basit bir tanımla güvenilir üçlü tabanlı deneylerle desteklenen anahtar yolları belirledik

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, ticari bir tedarikçiden 25 nanometre ve 60 ila 80 nanometre çapında ticari bakır nanotozlar edinin. Her nanopartikül boyutu için dağıtıcı olarak bir mililitre bir milimolar SDS kullanın. Daha sonra nanopartikülleri ultrasonik bir banyo kullanarak oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca dağıtın. Daha sonra, ilgili biyolojik kaynak merkezlerinden Escherichia coli, Acinetobacter baumannii ve Staphylococcus aureus suşlarını edinin. Her bir bakteriyi 37 santigrat derecede aerobik koşullar altında 10 mililitre LB suyunda kültürleyin. 600 nanometrede yaklaşık 0,5'lik bir optik yoğunluğa ulaşmak için bakteri kültürlerini LB ortamında seyreltin. Şimdi, her iki boyutta mililitre başına sıfır ila 100 mikrogram arasında bir konsantrasyon aralığı hazırlamak için stok bakır nanopartikül çözeltileri kullanın. 500 mikrolitre bakteri kültürünü mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 3.300 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı pipetledikten sonra, her tüpe nanopartiküllerin her iki boyutundan farklı konsantrasyonlar ekleyin. Kontrol gruplarını negatif kontrol olarak 500 mikrolitre PBS ve pozitif kontrol olarak 500 mikrolitre% 70 alkol ile tedavi edin. Daha sonra tüm numuneleri 24 saat boyunca 37 santigrat derecede dakikada 200 devirde çalkalayarak inkübe edin. İnkübasyondan sonra, bakterileri PBS ile yıkayın ve LB agar plakalarına yayın. Plakaları 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, tüm tedavi grupları için her plakadaki kolonileri sayın. Bakterileri iki saat boyunca beş mikromolar SBI, bir saat boyunca 0.5 mikromolar nekrosülfonamid, 30 dakika boyunca 100 nanomolar wortmannin veya 30 dakika boyunca 100 nanomolar Z-VAD ile tedavi edin. Tüm ön işlem tamamlandıktan sonra, tüm tüpleri 10 dakika boyunca 3.300 G'de santrifüjleyin. Ardından, ön işlem modülatörünü yıkamak için peleti 800 mikrolitre PBS'de yeniden süspanse edin. Yeniden askıya alınan peletleri dağıtın. Her tüpü santrifüjleyin, ardından süpernatanı atın. Çalkalama ile inkübe etmeden önce peletleri nanopartikül modülatör karışımlarında yeniden süspanse edin. Şimdi pozitif ve negatif kontroller olarak% 70 etanol ve PBS ekleyin. İnhibitörlerle tedavi edilen boş kontrol gruplarını dahil edin, ancak nanopartiküller içermez. İnkübasyondan sonra, hücre canlılığı reaktifini bir ila on hacim oranında pipetleyin ve inkübe edin. Kültürleri tekrar santrifüjledikten sonra, süpernatantları 96 oyuklu plakalara aktarın. Bir mikroplaka okuyucu kullanarak 560 nanometre uyarma ve 590 nanometre emisyonda floresan ölçün. Kalan süpernatanları eksi beşin kuvvetine 10'a ve eksi dördün kuvvetine 10'a seyreltin ve kültüre LB agar plakalarına yayın. Ertesi gün tek kolonileri sayın. Bakteri kültürlerini mikrosantrifüj tüplerine pipetleyin. Daha sonra kültürleri üç saat boyunca 405 nanometre ultraviyole ışığa maruz bırakın. Daha sonra, kültürleri iki saat boyunca 45 santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra bakterileri iki saat boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Soğuk işlemden sonra, bakterileri% 3 hidrojen peroksit içinde 30 dakika inkübe edin. LB suyunda 37 santigrat derecede bir kontrol grubu bulundurun. Şimdi bakterileri 24 saat boyunca mililitre başına bir ila 100 mikrogram arasındaki konsantrasyonlarda 20 veya 60 nanometre parçacıklı olarak tedavi edin. Daha sonra tedavi edilen bakterileri PBS ile iki kez yıkayın. Santrifüjlemeden sonra, bakteri peletlerini 2 ',7' diklorodihidrofloresein diasetat boyasının beş mikromolar çözeltisinde yeniden süspanse edin. 520 veya 530 nanometre emisyonunda floresan yoğunluğunu analiz edin. Escherichia coli'nin koloni sayıları, mililitre başına bir mikrogramda 20 nanometre bakır nanopartiküller ve mililitre başına beş mikrogramda 60 nanometre bakır nanopartiküller ile önemli ölçüde azaltıldı. Staphylococcus aureus, her iki nanopartikül boyutunun tüm konsantrasyonlarında koloni sayılarında önemli düşüşler gösterdi. Acinetobacter baumannii'de, koloni sayılarındaki azalma, 20 nanometre bakır nanopartiküllerin mililitresinde beş mikrogram ve 60 nanometre bakır nanopartiküllerin mililitresinde 10 mikrogram gerektiriyordu. Bakır nanopartikül işlemleri, tüm bakterilerde reaktif oksijen türlerinin üretimini indükledi ve 20 nanometre partikülleri, daha düşük konsantrasyonlarda pozitif hücrelerin en yüksek fraksiyonlarını gösterdi. Buna karşılık, 60 nanometre bakır nanopartikül işlemleri, tüm konsantrasyonlarda tutarlı reaktif oksijen türleri üretimine yol açtı. Programlanmış hücre ölümü modülatörü Z-VAD, düşük ila orta konsantrasyonlarda her iki nanopartikül boyutuyla tedavi edilen Escherichia coli'nin sağkalımını arttırdı. NSA tedavisi, Staphylococcus aureus'un tüm 20 nanometre bakır nanopartikül konsantrasyonlarında sağkalımını iyileştirdi. Acinetobacter baumannii, hem 20 hem de 60 nanometre bakır parçacık maruziyetinin mililitresinde bir, beş ve 10 mikrogram altında Z-VAD ile gelişmiş canlılık sergilerken, NSA 20 nanometre bakır nanoparçacık maruziyetinin mililitresi başına sadece 10 mikrogramda canlılığı artırdı.