İnsan CD59 / Intermedilysin Hücre Ablasyon Aracı Kullanılarak Renal Makrofajların Hızlı Tükenmesi

Kemokin güdümlü monosit geri kazanımına ve yaralanma sonrası immün sürveyansın niş oluşumuna odaklanarak, böbrek mikrofaj rejenerasyonunu incelemek için farelerde insan CD59 eksprese eden hücrenin intermedilysin aracılı oblasyonunu kullanıyoruz. Alanımızdaki son gelişmeler, makrofajları işe alan spesifik bir kemokini ve akut böbrek hasarını takiben immün sürveyansın nasıl yeniden kurulduğunu vurgulayarak renal makrofaj rejenerasyon mekanizmasını ortaya koymaktadır. Böbrek makrofajlarını gerçek zamanlı olarak ablate etmek, izlemek ve görselleştirmek için tamoksifen ile indüklenebilir kriyogenetik, intermedilisin ablasyonu, çok parametreli akış sitometrisi ve intravital mikroskopiyi birleştiriyoruz.

Temel zorluklar, sistemik inflamasyondan kaçınmak, yalnızca yerleşik makrofajları hedeflemek ve hassas renal mIcroenvironment'ı bozmadan hızlı rejenerasyonu ölçmektir. Monositlerin, CX3 CR1, CX3 CL1 sinyal eksenine kritik olarak bağlı bir süreç olan ablasyondan sonraki yedi gün içinde böbrek makrofajlarının %88'ini geri yüklediğini gösterdik. Başlamak için mısır yağını 42 santigrat dereceye ısıtın.

Mililitrede 20 miligram konsantrasyonda bir stok çözeltisi hazırlamak için 100 miligram tamoksifeni beş mililitre önceden ısıtılmış mısır yağında çözün. Tamoksifen'i 10 ila 12 haftalık erkek farelere gram vücut ağırlığı başına 100 mikrogram dozunda intraperitoneal olarak uygulayın. 15 gün sonra, farelere gram vücut ağırlığı başına 120 nanogramlık bir dozda tek bir intravenöz intermedilysin dozu enjekte edin.

Intermedilisin uygulamasından sonra bir, üç ve yedi günde akış sitometrisi gerçekleştirerek yerleşik makrofaj ablasyonunu ve müteakip rejenerasyonu izleyin ve onaylayın. Böbrek toplama için, ötenazi yapılmış bir farenin alt karın bölgesinde yatay bir kesi yapmak için ince forseps ve makas kullanın. Kesiği orta hat boyunca göğüs kafesi veya sternumun hemen altına kadar dikey olarak uzatın.

Göğüs boşluğunu ortaya çıkarmak için cildi ve kası nazikçe geri çekin. Kanın dolaşımdan akmasını sağlamak için sağ kulakçığı kesin. Sol ventriküle 21 ila 23 gauge iğne sokun.

Kanı temizlemek için perfüzyona 10 ila 20 mililitre soğuk PBS ile başlayın. Böbrekler soluk görünene kadar perfüzyona devam edin, bu da etkili kan klirensini gösterir. Böbrekleri dorsal vücut duvarına yerleştirin ve forseps ve makas kullanarak çevre dokulardan nazikçe ayırın.

Böbrek kapsüllerini çıkarın ve bozulmayı önlemek için böbrekleri hemen soğuk PBS'ye yerleştirin. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS, kollajenaz IV ve DNase I'i karıştırarak 100 mililitre sindirim enzimi kokteyli hazırlayın. Steril makas kullanarak böbrekleri beş mililitre HBSS içeren bir Petri kabında küçük parçalara ayırın.

Kıyılmış böbrek dokusunu, hazırlanan enzim çözeltisinin 10 mililitresini içeren 15 mililitrelik tüplere aktarın. Şimdi dokuyu ayırmak için tüpleri 37 santigrat derecede 30 dakika boyunca hafif çalkalayarak inkübe edin. Hücre kümelerini daha da parçalamak için bir pipet veya şırınga pistonu kullanarak dokuyu nazikçe öğütün.

Hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek kalıntıları giderin. Hücre süspansiyonunu 700 G'de 10 dakika boyunca 18 santigrat derecede santrifüjleyin. Ardından, tamponu dikkatlice boşaltın.

Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmeden önce peleti beş mililitre lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri yıkamak ve lizis tamponunu çıkarmak için PBS ekleyin. Elde edilen tek hücreli süspansiyonu daha fazla kullanıma kadar buz üzerinde tutun.

Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için, önce hücre peletini 10 mililitre %30 yoğunluklu gradyan çözeltisinde yeniden süspanse edin. Bunu bir santrifüj tüpünde üç mililitre %70 yoğunluklu gradyan çözeltisinin üzerine dikkatlice katmanlayın. Gradyanı 500 G'de ara vermeden 30 dakika santrifüjleyin.

Santrifüjlemeden sonra, %30 ve %70 çözeltiler arasındaki arayüz katmanını dikkatlice toplayın. Toplanan hücreleri 10 mililitre PBS ile iki kez yıkayın ve her yıkamayı 500 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Son hücre peletini 1.5 mililitrelik bir tüpte bir mililitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

Parlak alan mikroskobu altında bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve hücre konsantrasyonunu mililitrede altı hücrenin gücüne göre iki kez 10'a ayarlayın. Hücreleri 1.5 mililitrelik tüplerde 650 G'de beş dakika santrifüjleyerek pelet haline getirin ve hücre peletini bir mililitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin. Spesifik olmayan FC reseptör bağlanmasını bloke etmek için bir ila 200 seyreltmede anti CD 16 veya 32 antikoru ekleyin.

Hücreleri dört santigrat derecede 15 dakika inkübe ettikten sonra, hücreleri su canlı/ölü boyası ve CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE ve F4/80 BV 605 dahil olmak üzere prekonjuge bir antikor kokteyli ile boyayın. Antikor kokteylini doğrudan hücre süspansiyonuna ekleyin. Floroforları korumak için numuneyi karanlıkta dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Ardından hücreleri FACS tamponu ile iki kez yıkayın. Hücreleri buz üzerinde 30 dakika boyunca %1 paraformaldehit içinde sabitleyin. Ardından, kalan fiksatifi çıkarmak için hücreleri FACS tamponu ile iki kez yıkayın.

Bir akış sitometresi kullanarak lekeli ve sabit hücreler elde edin. Yazılımı kullanarak verileri analiz edin. CD45, CD11B ve F4/80 belirteçlerini kullanarak böbrek ve diğer dokuda yerleşik makrofajları ve mikrogliaları tanımlayın.

İleri ve yan saçılma profillerini kullanarak canlı hücreleri seçmek için ilk geçitleme gerçekleştirin. Yükseklik geçidine karşı ileri saçılma alanını kullanarak çiftleri ortadan kaldırın. Canlılık boyasını kullanarak ölü hücreleri hariç tutun.

CD45 pozitif popülasyonları geçitleyerek bağışıklık hücrelerini zenginleştirin. Böbrekte yerleşik makrofajları, geçit stratejisinde gösterildiği gibi CD45 pozitif kapısı içinde CD11b+F4/80hi hücreleri olarak tanımlayın. Mikroglia popülasyonlarını CD11b+CD45 ara hücreleri olarak tanımlayın ve son analizi yapın.

SDS sayfa jelinde 54 kilodalton yakınında, rekombinant intermedilysinin saflığını ve beklenen moleküler ağırlığını doğrulayan tek bir belirgin protein bandı gözlendi. Saflaştırılmış intermedilizin, doza bağlı bir şekilde güçlü hemolitik aktivite sergileyerek mililitrede 7.24 nanogramda %50 kırmızı kan hücresi lizizi ve mililitrede 650 nanogramda neredeyse tam lizis elde etti. Akış sitometrisi analizi, indüklenebilir insan CD59 bileşiği cre-R farelerinde intermedilisin uygulamasından bir gün sonra renal makrofajların başarılı ve seçici tükenmesini doğruladı ve kontrol farelerinde herhangi bir tükenme olmadı.

Renal makrofajlar üçüncü günde yeniden çoğalmaya başladı ve yedinci günde orijinal popülasyonlarının yaklaşık %88'ine ulaştı. Yeni rejenere renal makrofajların sadece %5'i yedinci günde insan CD59'unu eksprese etti, bu da yeniden popülasyonun in situ proliferasyondan ziyade öncelikle monosit alımı yoluyla gerçekleştiğini gösteriyor.