İnsan ve hayvan serumlarında antikor yanıtının tespiti için pratik ve uyarlanabilir bir immünoassay platformu olarak hücresiz nokta lekesi

Bu protokol, COVID-19 pandemisine yanıt olarak geliştirilen uyarlanabilir, erişilebilir ve uygun fiyatlı bir immünolojik test platformu olan hücresiz nokta kan tekniğini göstermektedir. Mevcut altın standart immünoassay yöntemleri, ELISA tekniğinin varyasyonlarını ve yanal akış testlerini içerir. Bölünmüş raporlanmış proteinler, elektrokimyasal arayüzler ve kolloidal nanopartiküller gibi teknolojileri kullanarak yeni immünolojik testlerin geliştirilmesine önemli bir ilgi olmuştur.

Buradaki zorluk, altın standart immünolojik testlerin çoğunun, pahalı ve sofistike moleküler bileşenlere ve ekipmanlara olan bağımlılık nedeniyle merkezi olmayan topluluklar tarafından erişilememesidir. Bu yeni CFDB immünoassay tekniği, ortaya çıkan salgınlara hızlı bir şekilde uyarlanabilir. Temel laboratuvar ekipmanlarını kullanır ve tamamen şirket içinde ve düşük kaynak ortamlarında üretilebilen moleküler bileşenlere dayanır.

Başlamak için, P0DTC9 erişim kodunu kullanarak UniProt veritabanından protein dizisini edinin. Optimizasyon aracında IDT kodunu kullanarak ecoli tabanlı ifade için diziyi optimize eden kod. Ticari sentez için optimize edilmiş diziyi suda yeniden süspanse edilmiş tek sarmallı bir DNA parçası olarak sipariş etmeden önce, optimize edilmiş diziyi ifade yapısı omurgası için bir SnapGene şablonuna ekleyin.

Bir PCR tüpünde ecoli BL21 hücresiz reaksiyonuna %10 PCR ürünü ekleyerek ilk beş mikrolitre ölçekli ekspresyon testi gerçekleştirin. Reaksiyonu 15 saat boyunca 30 santigrat derecede çalkalamadan inkübe edin. Nükleokapsid proteininin veya NP antijeninin ekspresyon kalitesini, hücresiz reaksiyonun bir mikrolitresini %12 SDS sayfa jeli üzerine yükleyerek değerlendirin ve bunu western blot için bir nitroselüloz membrana aktarın.

Hücresiz nokta leke tahlili için 15 nanomolar saflaştırılmış doğrusal ifade şablonu ürünü kullanarak bir mililitre ölçekli hücresiz reaksiyonu birleştirin İfade karışımını 15 mililitrelik konik bir tüpte 80 RPM'de 30 santigrat derecede 15 saat çalkalayarak inkübe edin. Western blot kullanarak ifade kalitesini değerlendirdikten ve ifade karışımından 50 mikrolitre alıntı yaptıktan sonra, alikotları eksi 20 santigrat derecede saklayın. Gösterildiği gibi, her biri iki milimetre çapında 12 x 12 daire içeren altı x altı santimetrelik bir desene sahip, 96 oyuklu bir plakanın tespit etme kapasitesine uyacak şekilde tasarlanmış bir ana ızgara görüntüsü kullanın.

Ana ızgarayı yazdırdıktan sonra, basılı ızgarayı iki kat yapışkan PCR plaka tavan filmi arasına sıkıca sıkıştırın, sandviçi dış ızgara sınırları boyunca boyutuna göre kesin. İki milimetrelik bir biyopsi yumruğu kullanarak, ızgara üzerindeki işaretli her daireyi oyun. 6,5 x 6,5 santimetrelik bir nitroselüloz membran parçası kesin, temiz bir yüzeyde ana ızgaranın altına yerleştirin ve yapışkan bant kullanarak sabitleyin.

Bir işaretleyici kalem kullanarak, numune lekelenmesinden sonra zarı kesmek için bir kılavuz olarak kullanılacak nitroselüloz zar üzerindeki en dıştaki daire konumlarını işaretleyin. Serum örneklerini PBS'de bir ila 10 oranında seyreltin. Bir mikro pipet kullanarak, her numuneden üç kopya 0,4 mikrolitre hacmini önceden belirlenmiş ızgara konumlarında nitroselüloz membran üzerine dağıtın.

Benekli numunelerin 10 dakika boyunca ortam sıcaklığında bağlanmasına ve kurumasına izin verin. Cımbız kullanarak nitroselüloz membranı dikkatlice alın ve işaretli dış daireler boyunca kesin. Membranı, 10 mililitre bloke edici çözelti içeren 10 santimetrelik bir petri kabına aktarın.

100 RPM'de hafifçe sallarken oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Hücre içermeyen antijen ekspresyon karışımının 50 mikrolitrelik alikotunu dondurucudan çıkarın ve çözüldükten sonra 10 santimetrelik bir petri kabında beş mililitre bloke edici çözeltiye ekleyin. Membranı doğrudan bu antijen içeren çözeltiye aktarın ve 100 RPM'de çalkalayarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin.

Bir saat sonra, membranı durulayın ve %0,05 Tween 20 içeren TBST'de yıkayın. Daha sonra, zara mililitre saflaştırılmış SpyCatcher, iki tepe, iki protein mililitre 10 mikrogram içeren 10 mililitre bloke edici tampon ekleyin ve zarı SpyCatcher tepesi içeren bir kaba yerleştirin. 100 RPM'de çalkalanarak bir saat inkübe edin: Membranı üç tamponlu tuzlu su veya TBS ile duruladıktan sonra, TBST'de beş dakika boyunca iki kez yıkayın ve ardından TBS'de son bir durulama yapın.

Leke görüntüleme cihazının yakınındaki temiz bir çalışma yüzeyine bir parça parafilm yapıştırın ve sabitleyin. Membrana dokunarak ve cımbız kullanarak fazla sıvıyı çıkarın, parafilmin üzerine yerleştirin. Zarın üzerine hemen üç mililitre gelişmiş kemilüminesans veya ECL çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında tam olarak 90 saniye inkübe edin.

Membranı muslukta kuruttuktan sonra, kemilüminesans uyumlu bir görüntüleme cihazına aktarın. Nitroselüloz membran üzerindeki üç boş konum da dahil olmak üzere nokta yoğunlukları elde etmek için cihazın görüntü analizi işlevini kullanın. Nokta başına sabit bir ölçüm hacmini koruyun.

Verileri bir elektronik tabloya aktarın ve her nokta konumunun doğru şekilde etiketlenmesini sağlayın. Üçlü nokta yoğunluklarının ortalamasını ve standart sapmasını hesaplayın. Nitroselüloz membran arka planını tüm numune ölçümlerinden çıkarın.

Ardından, pozitif veya negatif sonuçların yorumlanması için bir kesme değeri elde etmek için verilen denklemi kullanın. Son olarak, kesilen verileri bir çubuk grafiğe çizin. Önceden karakterize edilmiş ticari insan Sarah üzerinde hücresiz bir nokta leke tahlili yapıldı ve lekenin bir görüntüsü, karşılık gelen sinyal yoğunluğu tablosu ile birlikte bu şekilde sunuldu.

Hücresiz nokta leke testi, tüm negatif kontrol örneklerini ve çoğu pozitif örneği başarıyla tanımladı. Ulusal Mikrobiyoloji Laboratuvarı'nda hücresiz nokta leke testinin bağımsız olarak test edilmesi, 12 negatif ve 12 pozitif hasta örneğinin tümünü doğru bir şekilde tanımlayarak sağlamlığını doğruladı. Hücresiz nokta leke testi ayrıca SARS-CoV-2 ile enfekte hamster Sarah'da antikor tepkileri tespit etti ve yeniden enfeksiyondan beş gün sonra toplanan 24 enfeksiyon sonrası numuneden 18'inde pozitif sinyaller gözlenirken, tüm enfeksiyon öncesi numuneler negatif kaldı.