Juvenil Gilthead Çipura Başı Böbrek Lökositlerinin Flow Sitometri ile İzolasyonu, Fiksasyonu ve Karakterizasyonu

Bu protokol, akış sitometrisi ile çipuranın baş böbreğinden lökositlerin izolasyonunu, fiksasyonunu ve canlılık değerlendirmesini standartlaştırarak, kaliteden ödün vermeden yüksek verimli numune işlemeyi mümkün kılar.

Neubauer odaları ile manuel hücre sayımı ve lekeli kan yaymaları gibi geleneksel teknikler balık immünolojisinde yaygındır. Akış sitometrisi popüler hale geliyor, ancak balık çalışmalarındaki uygulaması sınırlı kalıyor. Geleneksel balık immünolojisi yöntemleri karaciğer yoğundur ve hatalara eğilimlidir. Yavru hayvan çalışmaları, saf lökosit elde etmedeki zorluklar ve anında canlılık değerlendirmesi ihtiyacı nedeniyle sınırlıdır ve bu da numune verimini kısıtlar.

Bu protokol, anahtar lökosit popülasyonlarını tanımlayarak ve canlı hücreleri ölü hücrelerden ayırt ederek ayrıntılı bağışıklık hücresi analizine olanak tanır. Fiksasyon, ölçeklenebilir, esnek ve verimli akış sitometrisi iş akışlarına izin vererek bir ay boyunca canlılığı korur.

Bulgularımız, bağışıklık mekanizmalarını ve hücre canlılığı üzerindeki çevresel etkileri ortaya çıkararak balık immünolojisini ilerletmekte ve su ürünleri yetiştiriciliğinde gelişmiş hastalık yönetimi stratejilerinin geliştirilmesine yardımcı olmaktadır.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, yavru yaldızlı çipura, Sparus aurata, istikrarlı bir ortam sağlamak için suyun sürekli olarak filtrelendiği ve yeniden sirküle edildiği devridaim su ürünleri yetiştiriciliği sistemlerine alıştırın. Optimum abiyotik parametreleri korumak için sistemin mekanik ve biyolojik filtreleme, havalandırma ve sıcaklık kontrolü içerdiğinden emin olun. Fotoğraf periyodu, sıcaklık, tuzluluk, pH ve çözünmüş oksijen seviyeleri gibi çevresel faktörleri çalışmanın özel ihtiyaçlarına göre ayarlayın. Yavru yaldızlı çipura balıklarını tank suyuyla dolu geçici bir tutma kabına nazikçe aktarmak için bir ağ kullanın. Balıkları ötenazi yaptıktan sonra, steril bir diseksiyon tepsisine bir balığı yan yatırın. Bir neşter ile, balığın ventral orta hattı boyunca havalandırma deliğinden solungaçlara doğru dikkatli bir kesi yapın. Kesiği uzatmak ve iç organları ortaya çıkarmak için diseksiyon makası kullanın. Vücut boşluğunun ön dorsal bölgesine yakın solungaçların hemen arkasında yer alan ve vertebral kolonun altındaki üst taraf boyunca uzanan baş böbreği bulun. Bir çift ince uçlu forseps ve makasla, baş böbreği daha iyi görselleştirmek için çevredeki dokuları dikkatlice temizleyin. Daha sonra baş böbreğini kaldırın ve çevresindeki dokulardan kurtarmak için etrafında hassas kesikler yapın. Eksize edilen baş böbreği hemen steril bir Petri kabı içine yerleştirilmiş bir hücre süzgecine yerleştirin. Steril bir Petri kabında iki mililitre Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisi veya HBSS'yi pipetleyin. Hücreleri çözeltiye bırakmak için bir şırınganın pistonunu kullanarak eksize edilen kafa böbreğini hücre süzgeci üzerinde maseratif hale getirin. Ardından, bir yoğunluk gradyan orta çözeltisi hazırlayın. Yoğunluk gradyanlı orta çözeltinin 600 mikrolitresini beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı tüplere pipetleyin. Petri kabından iki mililitre hücre süspansiyonunu yavaşça her tüpe aktarın. Fren kapalıyken dört santigrat derecede 45 dakika boyunca 400 g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra tüpü çıkarın ve lökosit halkasını gözlemleyin. Ardından, yaklaşık 100 mikrolitre lökosit halkasını iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne nazikçe aktarmak için steril bir Pasteur pipeti kullanın. Şimdi, HBSS ile hacmi iki mililitreye çıkarın ve hücreleri yavaşça yeniden askıya alın. Numuneyi 400 g'da dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tüpün altındaki peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. Daha sonra, nihai hücre konsantrasyonu mililitre başına 10.000 ila bir milyon hücre arasında olana kadar saflaştırılmış peleti bir mililitre HBSS'de yeniden süspanse edin. Reaktif boya içeren bir şişeye 50 mikrolitre dimetil sülfoksit ekleyin. Hücre yoğunluğunu mililitre başına bir milyon hücreye ayarladıktan sonra, hücre süspansiyonunun bir mililitresini iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Canlılık kontrol örneklerini verildiği gibi hazırlayın. Yedi dakika boyunca 70 santigrat derecede bir su banyosuna yerleştirerek üçüncü ve dördüncü tüplerde hücre ölümünü indükleyin. Hücreleri boyamak için, sulandırılmış floresan boyanın bir mikrolitresini bir mililitre hücre süspansiyonu içeren iki ve dört tüplere pipetleyin ve iyice karıştırın. Lekeli tüpleri oda sıcaklığında ışıktan koruyarak 30 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri bir mililitre HBSS ile iki kez yıkayın ve son peleti aynı tamponun 900 mikrolitresinde yeniden süspanse edin. Daha sonra hücreleri sabitlemek için 100 mikrolitre% 37 formaldehit pipetleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücreleri% 1 BSA içeren bir mililitre HBSS ile iki kez yıkadıktan sonra, aynı çözeltinin bir mililitresinde tekrar süspanse edin. Numuneleri dört santigrat derecede bir aya kadar buzdolabında saklayın. Sabit numune tüpünü analiz için akış sitometresi numune portuna yerleştirin. Tekiller geçidi içindeki her örnek için en az 10.000 olay kaydedin. Tüm verileri kaydedin ve harici sürücülere veya bulut depolamaya yedekleyin. Hücre boyutunu ve ayrıntı düzeyini değerlendirmek için ileri saçılma alanı ile yan saçılma alanını çizerek akış sitometrisi verilerini görselleştirin. Singlet hücre geçiti gerçekleştirin ve ileri saçılma alanı verus ileri saçılma yüksekliğini çizerek multipletleri hariç tutun. İleri ve yan saçılma profillerine dayalı olarak üç lökosit popülasyonunu tanımlayın. Canlı ve ölü hücreleri ayırt etmek için karşılık gelen floresan kanalında canlılık boya boyama eşiğini ayarlayın. Optimal koşullar altında, lenfositler, monositler ve granülositler lökosit popülasyonunun sırasıyla %31, %38 ve %31'ini oluştururken, termal stres altında lenfositler %21.3'e düştü, monositler %45.6'ya yükseldi ve granülositler %33.1'de sabit kaldı. Optimal koşullara maruz kalan numune, tüm lökosit popülasyonlarında canlı hücrelerin baskın olduğu daha yüksek canlılık sergiledi. Buna karşılık, termal olarak stresli numune, hücre ölümünde önemli bir artış gösterdi.