DNA/RNA Hibrit Komplekslerinden Telomerik Tekrarı Içeren RNA'nın Tahmini

Ecmel Mehmetbeyoglu Duman; Zeynep Yilmaz Sukranli; Hayriye Kilci; Serpil Taheri; Minoo Rassoulzadegan

doi:10.3791/67984

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

DNA/RNA Hibrit Komplekslerinden Telomerik Tekrarı Içeren RNA'nın Tahmini

585 görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/67984

⸱

5 Aralık 2025

Ecmel Mehmetbeyoglu Duman^*¹^,² , Zeynep Yilmaz Sukranli^*¹^,² , Hayriye Kilci¹ , Serpil Taheri¹^,² , Minoo Rassoulzadegan¹^,³

¹Betul-Ziya Eren Genome and Stem Cell Center, Erciyes University, ²Department of Medical Biology, Faculty of Medicine, Erciyes University, ³INSERM-CNRS, Université de Nice

^* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu protokol, DNA:RNA hibritlerinin ve ilişkili RNA'larının (TERRA dahil) birden fazla doku arasında izole edilmesini sağlar. Yaklaşımımız hibrit etkileşimlerin bir alt kümesini kapsa da, tam genom genelinde karakterizasyon için ek genomik haritalama gereklidir.

Özet

Telomerik tekrarlayan RNA (TERRA), daha yüksek ökaryotlardaki tüm telomerlerden transkribe edilen uzun ve kodlamayan bir RNA'dır ve bu moleküllerin yalnızca bir alt kümesi, telomerlerde kararlı DNA/RNA hibritleri oluşturur. Bu hibrit tahminleri tanımlamak ve saflaştırmak için ayrıntılı bir moleküler protokol belirledik. Bu kolaylaştırılmış yöntem, in vivo doğal olarak oluşan DNA/RNA hibrit etkileşimlerinin doğrudan çıkarılmasını sağlar ve tüm bu bölgelerin tespit edilmesinde uygulanabilir. Prosedürel adımları en aza indirerek, bu teknik, DNA'ya bağlı RNA'yı izole etmede oldukça verimlidir ve aşağı akış dizilemesinin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini tahmin eder. Guanidin izotiosiyanat reaktifi, tam hücre lizisi ve homojenizasyonu için kullanılır; nükleik asitlerin (DNA ve RNA), özellikle DNA/RNA hibritlerinin bütünlüğünü korur. Kloroform eklemek, santrifüjleme yoluyla faz ayrımını başlatır (üç farklı katman): alt fenol-kloroform fazı, ara faz ve üst sulu faz. Çekirdekten ve sitoplazmadan salınan RNA, sulu fazda kalırken, yüksek moleküler ağırlıklı DNA, DNA/RNA hibrit bölgeleri dahil, interfaz içinde sınırlıdır. İzopropil alkol ve ardından santrifüjleme ile sulu faz (serbest RNA), interfaz ve DNA, özellikle DNA/RNA hibritleri geri kazanılır. Kalan protein izlerini çıkarmak için örnek Proteinaz K ile kuluçka edilir. DNA, fenol/kloroform ekstraksiyonu, izopropil alkol ve santrifüjleme ile DNA'ya hibritleşmiş RNA serbest bırakılır.

Giriş

Genomun transkripsiyonu, üç zincirli yapılardan oluşan geçici hibrit moleküllerin, yani R-döngülerinin oluşmasına yol açar. Bu yapılar, kodlamayan ve kodlayan DNA zincirlerini içerir; kodlamayan iplik, tamamlayıcı RNA¹ ile hibritlerin oluşumuyla yerini değiştirir. Genom transkripsiyonu sırasında, her iki DNA zincirinden farklı hızlarda çok sayıda kodlamayan RNA üretilir. Bu RNA'ların çoğu kısa ömürlü ara madde olarak hizmet verir, ancak bazıları, özellikle telomerler ve centromerler 1 gibi kodlamayan bölgelerden kaynaklanan genom biyolojisini yöneten düzenleyici ağlarda kritik roller oynar^.