U2 OS Hücre Kültürü Kullanılarak Canlı Hücre, Floresan Mikroskobu için Bir Elektroporasyon Sitometrisi Protokolü
13 Haziran 2025
Elektroporasyon, moleküler kargoyu tanıtmak için hücre kültürlerinde geçici gözenekler oluşturmak için darbeli elektrik alanlarının (PEF'ler) kullanılmasıdır. Bu teknik son zamanlarda araştırma ve klinik ortamlarda yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, canlı hücreli, floresan mikroskobu gerçekleştirmek için yakın zamanda geliştirilen "Elektroporasyon Sitometri Sistemi" ni kullanarak elektroporasyon tekniklerini açıklıyoruz.
Bu araştırmanın kapsamı, darbeli elektrik alanlarının hücre davranışı üzerindeki etkisine, özellikle de elektroporasyonun hücre döngüsünü nasıl etkilediğine odaklanmaktadır.
Bu protokolün birincil avantajı, memeli hücre kültürünü kullanarak 72 saate kadar sürekli canlı hücre elektroporasyon deneyleri gerçekleştirme yeteneğidir. Laboratuvarımız, bu teknikleri daha düşük numune boyutlarına, daha az reaktif gereksinimlerine ve gelecekteki protokoller için daha iyi numune kontrolüne izin verecek olan mikroakışkanlar için uyarlamaya odaklanmıştır.
[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, U2OS FUCCI CA5 hücrelerini% 10 FBS ve% 1 penisilin streptomisin içeren 10 mililitre DMEM yüksek glikoz ile 10 santimetrelik bir plakada kültürleyin. Plakayı %5 karbondioksit ortamında 37 santigrat derecede inkübe edin. Kültür% 80 birleşmeye ulaştığında, medyayı plakadan aspire edin. Hücreleri PBS ile yıkayın, ardından bir mililitre% 0.25 tripsin ekleyin ve hücreleri ayırmak için 1.5 dakika inkübe edin. Ayrışmış hücreleri beş mililitre DMEM yüksek glikoz içinde yeniden süspanse ederek tripsini nötralize edin. Yeniden süspanse edilmiş kültürden 100 mikrolitrelik bir numune alın ve elektroporasyon sitometri sistemi odasının içindeki alt cam kapak kızağına yerleştirin. Numuneyi yerleştirdikten sonra haznenin %30 birleşim halinde olduğundan emin olun. Haznenin uzak ucuna yavaşça dört mililitre DMEM yüksek glikoz ekleyin ve sıvının numuneyi dışarı atmasını önleyin. Haznenin üzerine standart bir mikroskop lamı yerleştirin ve hazneyi 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Elektroporasyondan önce sistemin stabilize olmasını sağlamak için ters çevrilmiş floresan mikroskobu bir çevresel kontrol odası ile açın. Çevre odası stabilize olurken, elektroporasyon odası ile hızlı kurulum için darbe üreteci kondansatörüne ve yüksek voltaj anahtarına dijital bir multimetre bağlamak için timsah klipsli kablolar kullanın. Şimdi, mikroskopta 20x büyütmeyi seçin. Mikroskop yazılımında, FUCCI CA594 sistemindeki iki floresan proteine karşılık gelen FITC/GFP ve A5 Texas Red M Cherry kanallarının seçildiğinden emin olun. Uzun süreli görüntüleme sırasında fotoğrafın zarar görmesini önlemek için genellikle 0,05 saniyeden az olan düşük pozlama ayarlarını kullanın. Zaman atlamalı görüntülemeyi başlatmadan önce görüntü odağını ve kalitesini optimize etmek için test görüntüleri çekin. Fotoğraf hasarını azaltırken zaman atlamalı çekim başına yüksek hacimli hücre döngüsü verileri elde etmek için 24 saatlik bir süre boyunca her 10 dakikada bir üç ila altı farklı bakış açısından görüntü yakalamak için zaman atlamalı çekimi programlayın. Zaman atlamalı çekim sırasında kültür takibini optimize etmek için A594 kanalı için otomatik odaklamanın etkinleştirildiğinden emin olun. Elektroporasyon tamamlanana kadar yazılımı açık bırakın. Elektroporasyon sitometri odasını uygun bir çevre odası ile donatılmış mikroskoba yerleştirin. Elektroporasyondan önce, odayı kapalı tutun ve uygun hücre döngüsü koşullarını sürdürmek için çevresel sistemin çalışır durumda kaldığından emin olun. Çevre odasını açın ve nabız üretecine dijital bir multimetre takın, ardından timsah klipsi kablolarını kullanarak nabız üretecini hazne elektrotlarına bağlayın. Darbe üreteci kondansatörünü 180 volta kadar şarj edin. Dijital multimetre sıfır volt gösterene kadar nabzı hızlı bir şekilde hazneye boşaltın. Haznedeki tüm elektrik bağlantılarını çıkarın ve optimum kültür koşullarını sağlamak için hazne kapağını derhal değiştirin. Çevre odası güvenli bir şekilde yerine oturduğunda zaman atlamalı görüntülemeyi hemen etkinleştirin. Zaman atlaması tamamlandıktan sonra, yakalanan tüm görüntüleri tek bir video olarak kaydetmek için mikroskop yazılımını kullanın. Manuel niceleme için hücre özelliklerinin netliğini artırmak için görsel kaliteyi ayarlayın. Son olarak, hızlandırılmış videodaki hücre fazlarını izlemek için zaman içinde FITC ve A594 sinyallerindeki değişiklikleri gözlemleyin. Fuji sistemi kullanılarak, G1, S, G2, M fazlarının net bir şekilde ayırt edilmesini sağlayan, protein ekspresyonu ve ubikitinasyon ile bağlantılı renk değişiklikleri izlenerek görsel veriler toplandı. Bu, değişen koşullar altında hücre döngüsü ilerlemesinin doğrudan gözlemlenmesini sağladı. Bu şekil, senkronize edilmemiş ve S-fazı senkronize hücre kültürleri kullanılarak yapılan iki deney setinden toplanan temel verilerin bir özetini sağlar. Senkronize edilmemiş hücrelerde darbeli elektrik alan maruziyeti, G1, G2 ve M fazlarının ortalama uzunluğunu önemli ölçüde arttırırken, S fazı değişmeden kalmıştır. Senkronize hücrelerde, darbeli elektrik alan maruziyeti, G1, S ve G2 fazlarının sürelerinin azalmasına neden oldu, ancak sadece S ve G2 istatistiksel olarak anlamlıydı, ancak M fazı etkilenmeden kaldı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, moleküler yük tanıtımı için hücre kültürlerinde geçici gözenekler oluşturmak üzere darbeli elektrik alanlarını kullanan bir teknik olan elektroporasyonu ele alır. Odak noktası, canlı hücre floresan mikroskobisi için "Elektroporasyon Sitometre Sistemi" kullanımıdır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hücre biyolojisi
- Elektrofizyoloji
- Canlı hücre görüntüleme
Arka Plan
- Elektroporasyon, araştırma ve klinik uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaktadır.
- Çeşitli moleküllerin hücrelere tanıtılmasını sağlar.
- Teknik mikroakışkanlar için uyarlanabilir.
- Sürekli canlı hücre deneyleri 72 saate kadar gerçekleştirilebilir.
Çalışmanın Amacı
- Darbeli elektrik alanlarının hücre davranışı üzerindeki etkilerini araştırmak.
- Elektroporasyonun hücre döngüsünü nasıl etkilediğini incelemek.
- Gelişmiş örnek kontrolü için elektroporasyon tekniklerini uyarlama.
Kullanılan Yöntemler
- Elektroporasyon Sitometre Sisteminin kullanılması.
- Canlı hücre floresan mikroskopi teknikleri.
- Memeli hücre kültürlerine darbeli elektrik alanlarının uygulanması.
- Örnek boyutlarının azaltılması için mikroakışkan uyarlamaları.
Ana Sonuçlar
- Sürekli canlı hücre elektroporasyonunun fizibilitesini gösterdi.
- Elektroporasyonun hücre döngüsü dinamikleri üzerindeki etkisini gösterdi.
- Mikroakışkan uygulamalarının avantajlarını vurguladı.
- Gelecekteki deneysel protokoller için içgörüler sağladı.
Sonuçlar
- Elektroporasyon, hücre kültürlerinde moleküler tanıtım için değerli bir araçtır.
- Bu teknikle hücre davranışı üzerinde sürekli izleme mümkündür.
- Gelecekteki uyarlamalar, deneysel verimliliği ve kontrolü artırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Electroporation cytometry enables real-time, quantitative analysis of live-cell responses to pulsed electric fields, supporting mechanistic de-risking and target validation in early discovery. The protocol's integration with fluorescence microscopy and cell cycle reporters provides actionable insights into cell phase dynamics under experimental perturbation. This capability strengthens predictive confidence at key inflection points in the discovery pipeline.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of cell cycle modulation by external stimuli for functional target validation.
- Supports mechanistic de-risking by quantifying phase-specific cellular responses to electroporation.
- Facilitates hypothesis-driven exploration of cell behavior under controlled perturbations.
Screening & Assay Development
- Provides a validated live-cell system for reproducible, quantitative fluorescence-based readouts.
- Enables standardized time-lapse imaging for high-content screening of cell cycle effects.
- Supports assay scalability and platform reuse through microfluidic adaptation potential.
Translational & Preclinical Research
- Aligns cell cycle phase quantification with disease-relevant models for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement decisions by linking mechanistic insights to phenotypic outcomes.
- Supports biomarker development through real-time tracking of cell cycle transitions.
Pipeline & Workflow Integration
This protocol bridges early discovery and preclinical workflows by enabling continuous, quantitative monitoring of live-cell responses to pulsed electric fields.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by quantifying cell cycle phase changes post-electroporation.
- Screening: Delivers reproducible, high-content fluorescence data for comparative analysis across experimental conditions.
- Analytics: Provides quantitative phase duration measurements for robust statistical evaluation.
- Translational Research: Facilitates alignment of in vitro findings with disease-relevant cellular behaviors.
- Enterprise Reuse: Offers a modular platform adaptable to diverse cell types and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cell-based assays.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of live-cell experimentation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing actionable, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of discovery-stage assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live-cell imaging, fluorescence microscopy, and electroporation techniques.
- Demands access to environmental control chambers and high-resolution imaging platforms.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and data analysis workflows.
- Adaptable to microfluidic systems for reduced sample and reagent consumption.
- Dependent on robust statistical analysis to interpret phase-specific cell cycle changes.
