Nörodejeneratif Hastalıkların Tedavisinde Yeniden Programlanmış Kök Hücre Kaynaklı Öncü Hücrelerde Kemogenetik Düzenleme

Araştırmamız, klinik uygulamalar için etkili hücre tedavisi teknikleri geliştirmek için ileri teknolojileri entegre ederken, nörodejeneratif hastalığın altında yatan patojenik mekanizmayı göstermeye odaklanmaktadır. Son çalışmamız, Parkinson hastalığı fare modellerinde kemogenetik olarak değiştirilmiş kök hücreleri nakletti. Bir hücrenin nöron aktivitelerini tasarımcı ilaçlarla modüle ediyoruz, böylece elektrofizyolojik izleme ve davranışsal değerlendirme. Öncelikle genetik mühendisliği için CRISPR, nöral aktiviteyi izlemek için elektrofizyoloji ve Parkinson hastalığı modellerinde fonksiyon iyileşmesini değerlendirmek için davranışsal test kullanıyoruz. Greft hücrelerinin etkinliği, nörodejeneratif hastalığın tedavisinde kök hücre bazlı tedavide uygun endikasyon, sağkalım ve konakçı dokuya fonksiyonel katkı ile artar. Tümör oluşumu da dahil olmak üzere olumsuz sonuçlarla ilgili kontrolsüz hücresel aktivite.

İnsan tarafından yeniden programlanmış kök hücre ve sürücü nöronlarında teknolojiden yararlanmak, tasarımcı ilaç CNO'nun uygulanması yoluyla nöronal aktiviteleri hassas bir şekilde kontrol etmek için araçlar sağlar.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, 50 ila 100 nanogram doğrusallaştırılmış vektörü, bir parçayı ve ikinci parçayı bir ila üç molar oranda ve 2X klonlama karışımı ile birlikte yavaşça karıştırın. Gibson düzeneğini kullanarak homolog rekombinasyonu kolaylaştırmak için karışımı 55 santigrat derecede bir saat inkübe edin. AAVS1 bölgesini hedefleyen kılavuz RNA'yı PX458 vektörünün BBS1 bölgesine yerleştirin. Mililitre başına iki ila 5 milyon hücre arasında bir hücre yoğunluğunu hedefleyerek yeniden programlanmış kök hücreleri kültür ortamında tutun. Şimdi, iki ila 5 milyon hücreyi, her donör plazmidinden iki mikrogram ve iki mikrogram GRNA plazmidini 100 mikrolitre elektroporasyon tamponunda karıştırın. Elektroporasyon gerçekleştirmek için hücre ve plazmit karışımını bir küvete aktarın. Daha sonra, elektroporasyonlu hücreleri poli-D-lizin ve laminin ile kaplanmış altı oyuklu plakalara aktarın. İki mililitre kültür ortamında oyuk başına yaklaşık 500.000 hücre dağıtın. 72 saatlik elektroporasyondan sonra, floresan pozitif hücreleri sıralamak için bir akış sitometresi kullanın. ZsGreen algılaması için sıralayıcıyı FITC kanalıyla yapılandırın. Temel floresansı tanımlamak için tedavi edilmemiş indüklenmiş nöral kök hücreleri negatif kontroller olarak dahil edin. Tek ZsGreen pozitif hücreleri, poli-D-lizin ve laminin ile önceden kaplanmış 96 oyuklu plakalara yerleştirin ve oyuk başına 200 mikrolitre kültür ortamı ekleyin. Kültürü yedi ila 14 gün boyunca koruyun. Yeşil bir floresan protein filtre seti ile donatılmış ters çevrilmiş bir floresan mikroskobu kullanarak floresan sergileyen tek klonları izole edin. Pozitif hücreleri kaplanmış 48 oyuklu plakalar üzerinde genişlettikten sonra, bunları biri sürekli kültür ve diğeri genotipleme için olmak üzere iki kısma bölün. Aday klonlardan genomik DNA'yı çıkarın. Biri ilgilenilen genin yerleştirilmesini doğrulamak için, diğeri ise homozigot ve heterozigot klonları ayırt etmek için olmak üzere iki ana onarım kullanarak PCR karışımı hazırlayın. Hücreleri sindirin, PBS'de yıkayın ve üç dakika boyunca 250 G'de santrifüjleyin. Anestezi uygulanmış hayvan üzerinde mikrolitre başına beş mikrogram konsantrasyonda üç mikrolitre 6-hidroksidopamin tek taraflı stereotaksik enjeksiyonları yapın. Doğru koordinatları kullanarak doğru korpus striatumu hedefleyin. Lezyonları doğrulamak için ameliyattan dört hafta sonra salin içinde çözülmüş mililitre başına 0.5 miligramlık bir çözelti kullanarak kilogram başına bir miligram intraperitoneal apomorfin enjeksiyonu uygulayın. Parkinson hastalığı fare modeline hazırlanan hücre süspansiyonunun dört mikrolitresinin stereotaksik enjeksiyonunu uygulayın. Hücre naklini takiben silindir testini birden fazla zaman noktasında gerçekleştirin. Düz, yansıtıcı olmayan bir yüzeye 20 santimetre çapında ve 30 santimetre yüksekliğinde bir cam kab yerleştirin. Ardından, tam çapı yakalamak için silindirin üzerine bir üst görüş kamerası yerleştirin. Her fareyi silindirin ortasına yerleştirin ve oturum başına üç dakika boyunca eşzamanlı video kaydını başlatın. Seanstan sonra fareyi ev kafesine geri koyun. Üç dakikalık seans sırasında farelerin üst ekstremite hareketini değerlendirin. Bozulmuş ön ayak tarafından yapılan duvar temaslarının sayısını, her iki ön ayak tarafından yapılan toplam temaslara göre hesaplayın. İntraperitoneal enjeksiyon yoluyla kilogram başına 1.2 miligramlık bir dozda salin veya Klozapin N-oksit uygulayın. Klozapin N-oksit uygulamasını takiben Parkinson hastalığı fare modelindeki davranışsal modülasyonu değerlendirmek için silindir testini tekrar yapın. Beyni anestezi uygulanmış hayvandan çıkardıktan sonra ve hücresel bütünlüğü korumak için hemen buz gibi soğuk sakaroz bazlı yapay beyin omurilik sıvısına yerleştirin Bir vibratom kullanarak beyni 300 ila 400 mikrometre kalınlığında bölümlere ayırın. Gaz giriş ayarlarını 34 santigrat derecede %95 oksijen ve %5 karbondioksit ile dengelenecek şekilde ayarlayın. Beyin dilimlerini yapay beyin omurilik sıvısı ile dolu bir odaya aktarın. Cam pipetleri buzlu hücre içi çözelti ile doldurun ve elektrot direncinin yedi ila 10 megaohm arasında olduğundan emin olun. Dilimleri, 34 santigrat derecede oksijenli yapay beyin omurilik sıvısı ile dakikada iki mililitre süperfüzyonlu batık bir kayıt odasına monte edin. Pipetleri kızılötesi diferansiyel girişim kontrast mikroskobu altında motorlu mikromanipülatörler kullanarak konumlandırın. Bir gigaohm'dan daha büyük dirence sahip nöronları yamalamak için hafif emme kullanarak tüm hücre konfigürasyonunu oluşturun. Bir yama kelepçesi amplifikatörü kullanarak hücreleri eksi 70 milivoltta kelepçeleyin ve 10 kilohertz örnekleme hızında sekiz dakika boyunca temel spontan uyarıcı post-sinaptik akımlar elde edin. Temel ölçümden hemen sonra kayıt odasına 50 mikromolar klozapin N-oksit ekleyin. 16 dakika boyunca veri kaydetmeye devam edin ve spontan uyarıcı sinaptik sonrası akım frekansı veya genliğindeki değişiklikleri izleyin. Son olarak, klozapin N-oksit solüsyonunu taze yapay beyin omurilik sıvısı ile değiştirerek bir yıkama prosedürü gerçekleştirin ve sinaptik aktivitedeki iyileşmeyi değerlendirmek için kayda devam edin. Klozapin N-oksit kullanılarak yapılan hemogenetik modülasyon, hM4Di ile nakledilen farelerde kontralateral ön ayak hareketini azalttı ve hM3Dq ile nakledilen farelerde salin tedavisine kıyasla arttırdı, bu da çift yönlü davranışsal kontrolü gösterdi. Elektrofizyolojik kayıtlar, hM4Di ile nakledilen hücrelerin spontan uyarıcı post-sinaptik akımlarda daha uzun aralıklara ve daha küçük tepe genliklerine sahip olduğunu, hM3Dq nakledilen hücrelerin ise daha kısa aralıklara ve daha büyük genliklere sahip olduğunu ortaya koydu, bu da sinaptik aktivitenin ilgili baskılanmasını ve arttığını gösteriyor. İmmünofloresan analizi, nakledilen hM4Di ve hM3Dq hücrelerinde tirozin hidroksilaz ve ZsGreen'in in vivo ekspresyonunu doğruladı ve başarılı greft entegrasyonunu destekledi.