Karmaşık dışkı topluluklarının sürekli kültürü için biyoreaktör düzeneği

Bakterilerin kanser gelişimi, ilerlemesi ve tedavi yanıtı üzerindeki etkilerine odaklanarak, konakçı bakteri etkileşimlerini ve içsel ve dışsal faktörlerin sağlığı nasıl etkilediğini inceliyoruz. Bakteri topluluklarında anti-PD-1 immün kontrol noktası inhibitörlerini inceledik ve bakteriyel metabolitlerin anti-PD-1 tedavisinin etkinliğini artırdığını bulduk.

Konak faktörlerinin mikrobiyom üzerindeki etkisini in vivo olarak izole etmek, çoklu etkiler nedeniyle zordur. Mikrobiyoreaktör dizisi, mikrobiyal topluluklar üzerindeki doğrudan etkilerini açıklığa kavuşturarak belirli süreçlerin kontrollü bir şekilde incelenmesine olanak tanır. Bu protokol, araştırmacıların deneyleri nispeten hızlı bir şekilde paralel olarak yürütmelerini sağlarken, kontrollü koşullar altında dışkı topluluklarını yetiştirmek için uygun maliyetli bir yöntem sunar.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, 3D baskılı altı kuyulu bir reaktör dizisi edinin. 1/8 inç PTFE borudan on iki adet 25 milimetrelik şerit kesin ve uçları tıraş etmek için bir tıraş bıçağı kullanın. Her şeridin bir ucunu, 25 ila 28 dişli bir bağlantı parçasına sahip bir erkek Luer'in vida dişi açıklığına sokun. Bağlantı parçalarını belirlenen atık ve s'ye güvenli bir şekilde vidalayın.ampdizinin açıklıkları. Şimdi, her reaktör kuyusuna bir mikro karıştırma çubuğu yerleştirin. Her bir reaktör kuyusunun kaynak deliklerine bir erkek 1/4-28 dişli bağlantı parçasını vidalayın. Dişi Luer hortum çubuğu adaptör bağlantı parçalarını, her bir reaktör kuyusunun atık ve kaynak bağlantıları için dişli bağlantı parçalarına vidalayın. Ardından dişi Luer X'i 3-32/2 inç hortum ucu adaptör bağlantı parçalarına vidalayın.ample portları için 1/4-28 dişli bağlantı parçalarına. Hortum dikeni adaptörlerinin üzerine lastik bir septum yerleştirin ve üst kısmı katlayın. Ardından, atık ve kaynak hatları için iki set E-LFL 2.06 milimetre boru kesin. Daha kolay bağlantı için boruyu yumuşatmak için sıcak su kullanın. Boruyu dişi Luer X'e kaynak ve atık bağlantıları için 1/8 inç hortum dikeni adaptör bağlantı parçalarına takın. Şimdi bir erkek Luer'i X kilit halkası ile borunun diğer ucuna 1/8 inç hortum dikeni adaptörüne sabitleyin. Dişi bir Luer X'i 1/16 inç hortum dikeni adaptörüne vidalayın. Uygun boyuttaki iki durdurmalı boruyu ilgili kaynağa ve atık bağlantılarına bağlayın. Ardından, borunun diğer ucuna 1/16 inç hortum dikeni adaptör bağlantısına başka bir dişi Luer X sabitleyin. Bunu tüm kaynak ve atık bağlantı parçaları için tekrarladıktan sonra, 1/8 inç hortum ucu adaptör bağlantı parçalarına X kilit halkalı bir erkek Luer takın. Tüm parçalar için her iki duraklı boru bölümünün sonundaki boş dişi Luer X - 1/16 inç hortum dikeni adaptörüne bir ucunu takın. Bunu tüm kaynak ve atık bağlantı parçaları için tekrarladıktan sonra, dişi Luer T'nin zıt uçlarını kullanarak reaktör kuyuları birinci ve ikinci reaktör kuyularının kaynak hatları için E-LFL 2.06 milimetre borusunu bağlayın. Ardından, kilit halkası X olan erkek Luer ile beş santimetrelik bir boru parçasını, her iki uçta 1/8 inç adaptör bağlantı parçalarına T'nin orta çıkışına sabitleyin ve ikinci bir T bağlantısına yol açın. Şimdi üçüncü reaktör için E-LFL 2.06 milimetre kaynak borusunu ikinci T'nin karşı tarafına bağlayın. Bir ucunda kilit halkası X - 1/8 inç adaptöre sahip bir erkek Luer ve diğer ucunda kilit halkası X - 1/8 inç adaptöre sahip bir dişi Luer bulunan başka bir beş santimetrelik boru segmenti takın. Ardından, 25 santimetrelik bir E-LFL 2.06 milimetre boru parçasının bir ucuna 1/8 inç hortum dikeni adaptörüne X kilit halkalı bir erkek Luer takın. Bir dişi Luer X'i diğer ucuna 1/8 inç hortum dikeni adaptör bağlantısına sabitleyin ve alüminyum folyo ile kapatın. Atık toplama şişesini monte etmek için, iki delikli bir kapağı iki litrelik bir şişeye gevşek bir şekilde sabitleyin. Erkek 1/4-28 dişli bağlantı parçalarını kapağın her iki deliğine de yerleştirin. Ardından, kapaktaki önceden takılmış PTFE boruya bağlanmayan erkek dişli bağlantıya 1/8 inç hortum dikeni adaptörlü bir dişi Luer takın. Şişedeki hortum dikeni adaptörüne beş santimetrelik bir E-LFL 2.06 milimetre boru parçası bağlayın. Folyo ile kaplamadan önce borunun diğer ucuna 1/8 inç hortum diken adaptörüne X kilit halkalı bir erkek Luer takın. Son olarak, 121 santigrat derece ve 15 psi'de 45 dakika otoklavlamadan önce tüm şişe kapağını alüminyum folyo ile kapatın. Otoklavlama tamamlandıktan sonra, bağlantı parçalarını ve folyo contaları sıkın ve reaktörleri kullanmadan önce 48 saat anaerobik bir odaya yerleştirin. Anaerobik odanın içindeki reaktör dizisini 1,600 RPM'ye ayarlanmış bir manyetik karıştırma plakası üzerinde hizalayın. Ardından, hem kaynak hem de atık hatları için iki durdurmalı boruyu ilgili peristaltik pompalardaki kelepçelere takın. cl'yi kilitleyinamps kullanmadan 25 saatten daha kısa bir süre önce yapılırsa. Aksi takdirde, borudaki aşınmayı azaltmak için gevşek bırakın. Şimdi folyo kapağını kaynak şişeden çıkarın. Bağlantı parçalarını erkek Luer'e 1/4-28 dişli bağlantı parçalarına vidalayın ve bu açıklıkların dahili PTFE boruya bağlı olduğundan emin olun. Folyo kapakları çıkarın ve hem kaynak şişenin hem de atık şişenin beş santimetrelik havalandırma hattına 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresi takın. Reaktörü doldurmaya başlamak için akışa ılımlı bir hızda başlayın. Aşırı dolmayı veya her bir kuyunun tamamen boşalmasını önlemek için her bir reaktör kuyusunun içindeki bel borusunun kaynak borudan daha düşük yerleştirildiğinden emin olun. Reaktörler dolmaya başladığında, reaktörleri gece boyunca gazdan arındırmak için terk etmeden önce tüm kuyuların aynı hacme ulaştığını ve ortamın bele aktığını kontrol edin. Deney materyallerini 24 saat boyunca anaerobik odaya aktararak başlayın. İhtiyaç duyulan dışkı inokülum miktarını hesapladıktan sonra, korunmuş dışkı örneklerini kriyojenik şişelerde anaerobik odaya aktarın ve 15 dakika çözülmelerine izin verin. Geniş delikli bir pipet ucu ile dışkı malzemesini kriyojenik şişelerden 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Partikülleri çökeltmek için kapalı tüpü 200 g'da beş dakika santrifüjleyin. Tüpleri anaerobik odaya geri aktarın. Ardından süpernatanı çıkarın. 5.7 gram dışkı katısını 50 mililitrelik yeni bir konik tüpe aktarmak için bir otoklav laboratuvar spatulası kullanın. Tüpe 17.1 mililitre anaerobik steril salin ekleyin ve sıkıca kapatın. Şimdi, daha önce gösterildiği gibi santrifüjlemeden önce tüpü beş dakika boyunca vorteksleyin. Her reaktörün üstündeki septayı en az iki dakika sterilize etmek için %10'luk bir çamaşır suyu laboratuvar mendili kullanın. Numuneleri anaerobik odaya geri koyduktan sonra, süpernatanı yeni 50 mililitrelik konik tüplere pipetleyin. Şimdi 3.8 mililitre dışkı bulamacı süpernatanı, 16 gauge 1.5 inçlik iğnelerle donatılmış altı ayrı beş mililitrelik şırıngaya aktarın. Çamaşır suyu mendilini reaktör septasından çıkarın. Daha sonra iğneyi septumdan geçirin ve reaktörleri gece boyunca oturmaya bırakmadan önce her reaktöre yavaşça 3.8 mililitre dışkı bulamacı enjekte edin. 16 ila 18 saatlik bir inkübasyondan sonra, reaktöre akışı başlatın. Dışkı bulamacını enjekte ettikten hemen sonra manyetik karıştırma plakasını maksimum hıza ayarlayın. Her iki replike reaktördeki mikrobiyal topluluk bileşimi zamanla değişti ve farklı türler günler boyunca değişken nispi bolluk gösterdi. Clostridium cinsleri gibi titiz anaerobik bakteriler, her reaktörde tüm zaman noktalarında tutarlı bir şekilde tespit edildi.