Seçilmiş Doku Bölgelerini Kullanan Kütle Spektrometresi Tabanlı Proteomikler için Kolaylaştırılmış Bir Yaklaşım
April 18th, 2025
Burada, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitlerinde izole edilmiş ilgi alanlarını kullanarak kütle spektrometresi tabanlı bir proteomik yöntem oluşturuyoruz. Bu protokol, arşivlenmiş formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü doku kesitlerindeki belirli doku alanlarından proteomu analiz etmek için kullanılır.
Kütle spektrometresi kullanarak daha yüksek doku örneklerinin belirli bölgelerinde proteomu incelemek için aerodinamik bir yöntem geliştirdik. Amacımız, yüksek doğruluk ve güvenilirlik elde etmek için numune hazırlama ve kütle spektrometresi analizi dahil olmak üzere proteomik tekniği geliştirmektir. FFPE tabanlı uzamsal proteomikteki bir zorluk, genel protein kapsamını azaltan eksik protein sindirimidir.
Bunların üstesinden gelmek, proteom derinliklerini ve doğruluğunu iyileştirmek için optimize edilmiş sindirim protokolleri ve gelişmiş kütle spektrometresi stratejileri gerektirir. Farklı pankreas hastalığı türlerinde farklı protein değişiklikleri belirledik ve iyi huylu ve kanser öncesi durumlar arasındaki farklar hakkında fikir verdik. Bu bulgular pankreas kanserinin erken teşhisine yardımcı olabilir.
Doku bölgelerinde yüksek çözünürlüklü protein haritalaması elde etmek için hasta proteinaz yöntemini ilerletmeyi amaçlıyoruz. Kütle spektrometresi tabanlı proteomikleri kullanarak, biyobelirteç keşfine katkıda bulunan bölgeye özgü moleküler imzaları tanımlamaya çalışıyoruz. Yaklaşımımız, seçilen FFPE doku bölgelerinden hızlı bir şekilde yüksek kaliteli proteom verileri üretmek için bu hasta tuzaklarını ve ön hazırlığı veriden bağımsız durum kütle spektrometresi ile entegre eder.
Bu yöntem, uzamsal proteomun büyük ölçüde kantitasyonunu sağlar. Başlamak için, bir patolog tarafından belirtilen ilgilenilen bölge ile hematoksilen ve eozin lekeli veya immünohistokimyasal lekeli bir doku lamı hazırlayın. Lekelenmemiş doku slaytını ve lekeli doku slaytını arka arkaya yerleştirin ve uygun hizalamayı sağlayın.
Bir neşter kullanarak, ilgi çekmeyen doku bölgelerini çıkarın ve ilgilenilen doku bölgelerini slaydın merkezine doğru kazıyın. Toplanan dokuyu temiz bir 1.5 mililitre düşük protein bağlayıcı tüpe aktarın ve her tüpe 180 mikrolitre SDS lizis tamponu ekleyin. Beş saniye açık ve beş saniye kapalı 10 döngü boyunca% 20 genlikte prob sonikasyonu gerçekleştirin.
Şimdi, numuneleri 1.000 G'lik bir hızı korurken 3.5 saat boyunca 100 santigrat derecede inkübe edin, inkübasyondan sonra, numunenin oda sıcaklığında 10 dakika soğumasına izin verin. Daha sonra, doku kalıntılarını süpernatandan ayırmak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı temiz, etiketli bir tüpe toplayın ve daha fazla kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Aseton çökeltmesi için, 100 ila 300 mikrograma karşılık gelen protein örneğini aseton uyumlu bir tüpe yerleştirin. Ardından, eksi 20 santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş buz gibi soğuk asetonu, numune hacminin beş katı bir hacimde ekleyin. Karışımı eksi 20 santigrat derecede 18 saat inkübe edin.
İnkübasyondan sonra, tüpü 15 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjleyin. Protein peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. Eksi 20 santigrat derecede temperlenmiş 500 mikrolitre aseton ve santrifüj ekleyin.
Süpernatanı boşalttıktan sonra, numuneyi havayla kurutun. Süspansiyon tutucu lizis tamponunu deiyonize suda hazırlayın. Ardından, hazırlanan tampondan 40 mikrolitreyi numune tüpüne ekleyin ve havayla kurutulmuş protein peletini çözmek için iyice girdaplayın.
Numuneyi 35 dakika boyunca 1.000 G'de 100 santigrat derecede çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, numuneye 10 mikrolitre alkilleyici reaktif ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında 300 G'de bir saat inkübe edin. Kimyasal bir çeker ocak içinde, numuneye beş mikrolitre %10 trikloroasetik asit ekleyin ve toplam hacmi 55 mikrolitre yapın.
Birden az olduğundan emin olmak için pH kağıdı kullanarak numunenin pH'ını kontrol edin. Daha sonra, proteinleri yakalamak için numuneye 350 mikrolitre bağlayıcı tampon bir ekleyin. Süspansiyon yakalama kolonunu iki mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve çözünmeyen herhangi bir malzeme de dahil olmak üzere tüm numuneyi kolona aktarın.
Proteinleri yakalamak için sütunu 50 saniye boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin. Ardından, 400 mikrolitre yıkama tamponu iki ekleyin. Santrifüjlemeden sonra akışı atın.
Son yıkamanın ardından, tamponun tam geçişini sağlamak için sütunu 4.000 G'de 1.25 dakika santrifüjleyin. Süspansiyon tutma kolonuna 125 mikrolitre sindirim tamponu ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için kapağını kapatın. Numuneyi 37 santigrat derecede 18 saat çalkalamadan inkübe edin.
Şimdi, süspansiyon yakalama kolonuna 80 mikrolitre elüsyon tamponu bir ekleyin ve 1.25 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin. Ayrıştırılmış peptitleri çekin ve temiz yeni bir tüpe aktarın. Peptit miktar tayininden sonra, 20 mikrogram peptidi liyofilize edin.
Liyofilize peptitleri% 0.1 formik asit suyunda% 3 asetonitril içeren 40 mikrolitre sulu tamponda yeniden çözün ve bir sonikasyon banyosunda 10 dakika boyunca sonikat yapın. Numuneyi 60 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı kütle spektrometresi analizi için şişelere aktarın. Nano-sıvı kromatografi kütle spektrometresi sisteminin otomatik örnekleyicisini kullanarak her numuneden iki mikrolitre enjekte edin.
Dakikada 100 nanolitrede beş ila 35% asetonitril arasında 127 dakikalık bir gradyan kullanarak üç mikrometre C18 malzemesi ile paketlenmiş ters faz sütunu üzerinde ayrı peptitler. Peptitleri bir nanosprey iyon kaynağı aracılığıyla iyonize edin ve bunları Orbitrap tabanlı bir kütle spektrometresine aktarın. Dar aralıklı veriden bağımsız bir edinim yöntemi kullanarak peptitleri analiz edin.
FFPE doku işleme sırasında hassas ilgi alanı izolasyonu, farklı pankreatik kistik formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokular arasında elde edildi. Her bir pankreatik kistik neoplazm tipi için biyolojik tripreplikatlar arasında tekrarlanabilir toplam iyon kromatogramları elde edildi. Sıvı kromatografi kütle spektrometresi analizi 9.703 protein tanımladı.
Tanımlanan tüm proteinlerin bolluğu, kapsamlı proteom kapsamını gösteren 6.25 büyüklük sırasını kapsıyordu ve bilinen pankreas kanseri protein belirteçleri ölçüldü. İntraduktal papiller müsinöz neoplazmlarda 457 yukarı regüle ve 476 aşağı regüle olmak üzere toplam 933 diferansiyel olarak eksprese edilen protein tanımlandı. Biyoinformatik analiz, diferansiyel olarak eksprese edilen proteinlerin pankreas kanseri ile ilgili çeşitli yolaklarla ilişkili olduğunu ortaya koydu.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, formalin sabitlenmiş, parafinle gömülü doku kesitlerinde belirli ilgi alanlarını analiz etmek için kütle spektrometrisi tabanlı bir proteomik yöntem sunar. Protokol, arşivli doku örneklerinde proteomik analizin doğruluğunu ve güvenilirliğini artırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Proteomik
- Kütle Spektrometrisi
- Patoloji
Arka Plan
- Formalin sabitlenmiş, parafinle gömülü (FFPE) dokular araştırmada yaygın olarak kullanılmaktadır.
- Belirli doku bölgelerinde proteom çalışması, hastalık mekanizmalarına dair içgörüler sağlayabilir.
- Zorluklar arasında protein kapsamını etkileyen eksik protein sindirimi bulunur.
- Doğru analiz için optimize edilmiş protokoller gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Belirli doku bölgelerinde proteomik analiz için yöntem geliştirmek.
- Numune hazırlama ve kütle spektrometrisi tekniklerini geliştirmek.
- Pankreas hastalıklarında protein değişikliklerini tanımlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Proteomik analiz için kütle spektrometrisi.
- FFPE örneklerinden belirli doku bölgelerinin izolasyonu.
- Protein analizi için optimize edilmiş sindirim protokolleri.
- Pankreas koşullarında protein değişikliklerinin karşılaştırmalı analizi.
Ana Sonuçlar
- Farklı pankreas hastalığı türleri arasında farklı protein değişiklikleri tanımlandı.
- İyi huylu ve önkanseröz koşullar arasındaki farklılıklar hakkında içgörüler elde edildi.
- Yöntem, proteomik analizin derinliğini ve doğruluğunu artırır.
- Bulgular, pankreas kanserinin erken teşhisine yardımcı olabilir.
Sonuçlar
- Geliştirilen yöntem, FFPE dokularında proteom çalışmasını iyileştirir.
- Optimize edilmiş protokoller, protein sindiriminde karşılaşılan zorlukların üstesinden gelebilir.
- Bu araştırma, pankreas hastalıklarını ve potansiyel tanısal uygulamaları anlamaya katkıda bulunur.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Spatially resolved proteomics using FFPE tissue regions addresses a critical need for high-resolution molecular profiling in discovery-stage oncology research. This streamlined workflow enables robust quantitation and comparative analysis of protein expression across disease-relevant tissue microenvironments, supporting predictive confidence in early biomarker and target validation. Integrating pathologist-guided region selection with optimized sample preparation and high-throughput MS analysis enhances portfolio decision-making at the interface of discovery and translational research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of region-specific proteomic alterations in disease and benign tissue contexts.
- Supports functional target validation by quantifying known and novel protein markers in situ.
- Facilitates mechanistic de-risking through pathway-level analysis of differentially expressed proteins.
- Improves predictive confidence for biomarker discovery and early triage of candidate targets.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, spatially defined tissue samples for downstream quantitative proteomics workflows.
- Standardizes sample preparation and MS analysis to ensure reproducibility and scalability across studies.
- Generates high-quality, quantitative proteome data suitable for comparative screening of disease states.
- Enables reliable evaluation of protein expression changes for assay development and optimization.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular findings from FFPE tissues with disease-relevant pathways implicated in cancer progression.
- Provides continuity from discovery-stage proteomic profiling to preclinical model validation.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by linking molecular signatures to clinical phenotypes.
- Enhances translational biomarker alignment through comprehensive protein quantification in archived tissues.
Pipeline & Workflow Integration
This integrated protocol bridges early discovery, target validation, and translational research by enabling spatially resolved proteomic analysis of FFPE tissues.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis testing and pathway clarification by quantifying region-specific protein expression.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for robust comparison of disease and control tissue regions.
- Analytics: Provides comprehensive protein abundance measurements and differential expression analysis across conditions.
- Translational Research: Connects proteomic signatures to disease mechanisms and potential clinical biomarkers.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized, scalable workflow for repeated use across diverse tissue types and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target and biomarker validation.
- Operational Value: Streamlines sample preparation, enhances reproducibility, and supports high-throughput scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling robust molecular profiling early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of discovery and translational programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in tissue macrodissection, proteomics sample preparation, and mass spectrometry operation.
- Demands access to high-resolution MS instrumentation and robust bioinformatics infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for region selection and data analysis protocols.
- Adaptable to various FFPE tissue types and disease models with appropriate optimization.
- Potential limitations include protein recovery variability and the need for pathologist collaboration for ROI identification.
