Seçilmiş Doku Bölgelerini Kullanan Kütle Spektrometresi Tabanlı Proteomikler için Kolaylaştırılmış Bir Yaklaşım

Kütle spektrometresi kullanarak daha yüksek doku örneklerinin belirli bölgelerinde proteomu incelemek için aerodinamik bir yöntem geliştirdik. Amacımız, yüksek doğruluk ve güvenilirlik elde etmek için numune hazırlama ve kütle spektrometresi analizi dahil olmak üzere proteomik tekniği geliştirmektir. FFPE tabanlı uzamsal proteomikteki bir zorluk, genel protein kapsamını azaltan eksik protein sindirimidir.

Bunların üstesinden gelmek, proteom derinliklerini ve doğruluğunu iyileştirmek için optimize edilmiş sindirim protokolleri ve gelişmiş kütle spektrometresi stratejileri gerektirir. Farklı pankreas hastalığı türlerinde farklı protein değişiklikleri belirledik ve iyi huylu ve kanser öncesi durumlar arasındaki farklar hakkında fikir verdik. Bu bulgular pankreas kanserinin erken teşhisine yardımcı olabilir.

Doku bölgelerinde yüksek çözünürlüklü protein haritalaması elde etmek için hasta proteinaz yöntemini ilerletmeyi amaçlıyoruz. Kütle spektrometresi tabanlı proteomikleri kullanarak, biyobelirteç keşfine katkıda bulunan bölgeye özgü moleküler imzaları tanımlamaya çalışıyoruz. Yaklaşımımız, seçilen FFPE doku bölgelerinden hızlı bir şekilde yüksek kaliteli proteom verileri üretmek için bu hasta tuzaklarını ve ön hazırlığı veriden bağımsız durum kütle spektrometresi ile entegre eder.

Bu yöntem, uzamsal proteomun büyük ölçüde kantitasyonunu sağlar. Başlamak için, bir patolog tarafından belirtilen ilgilenilen bölge ile hematoksilen ve eozin lekeli veya immünohistokimyasal lekeli bir doku lamı hazırlayın. Lekelenmemiş doku slaytını ve lekeli doku slaytını arka arkaya yerleştirin ve uygun hizalamayı sağlayın.

Bir neşter kullanarak, ilgi çekmeyen doku bölgelerini çıkarın ve ilgilenilen doku bölgelerini slaydın merkezine doğru kazıyın. Toplanan dokuyu temiz bir 1.5 mililitre düşük protein bağlayıcı tüpe aktarın ve her tüpe 180 mikrolitre SDS lizis tamponu ekleyin. Beş saniye açık ve beş saniye kapalı 10 döngü boyunca% 20 genlikte prob sonikasyonu gerçekleştirin.

Şimdi, numuneleri 1.000 G'lik bir hızı korurken 3.5 saat boyunca 100 santigrat derecede inkübe edin, inkübasyondan sonra, numunenin oda sıcaklığında 10 dakika soğumasına izin verin. Daha sonra, doku kalıntılarını süpernatandan ayırmak için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı temiz, etiketli bir tüpe toplayın ve daha fazla kullanılana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Aseton çökeltmesi için, 100 ila 300 mikrograma karşılık gelen protein örneğini aseton uyumlu bir tüpe yerleştirin. Ardından, eksi 20 santigrat dereceye kadar önceden soğutulmuş buz gibi soğuk asetonu, numune hacminin beş katı bir hacimde ekleyin. Karışımı eksi 20 santigrat derecede 18 saat inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, tüpü 15 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjleyin. Protein peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. Eksi 20 santigrat derecede temperlenmiş 500 mikrolitre aseton ve santrifüj ekleyin.

Süpernatanı boşalttıktan sonra, numuneyi havayla kurutun. Süspansiyon tutucu lizis tamponunu deiyonize suda hazırlayın. Ardından, hazırlanan tampondan 40 mikrolitreyi numune tüpüne ekleyin ve havayla kurutulmuş protein peletini çözmek için iyice girdaplayın.

Numuneyi 35 dakika boyunca 1.000 G'de 100 santigrat derecede çalkalanan bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra, numuneye 10 mikrolitre alkilleyici reaktif ekleyin ve numuneyi oda sıcaklığında 300 G'de bir saat inkübe edin. Kimyasal bir çeker ocak içinde, numuneye beş mikrolitre %10 trikloroasetik asit ekleyin ve toplam hacmi 55 mikrolitre yapın.

Birden az olduğundan emin olmak için pH kağıdı kullanarak numunenin pH'ını kontrol edin. Daha sonra, proteinleri yakalamak için numuneye 350 mikrolitre bağlayıcı tampon bir ekleyin. Süspansiyon yakalama kolonunu iki mililitrelik bir tüpe yerleştirin ve çözünmeyen herhangi bir malzeme de dahil olmak üzere tüm numuneyi kolona aktarın.

Proteinleri yakalamak için sütunu 50 saniye boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin. Ardından, 400 mikrolitre yıkama tamponu iki ekleyin. Santrifüjlemeden sonra akışı atın.

Son yıkamanın ardından, tamponun tam geçişini sağlamak için sütunu 4.000 G'de 1.25 dakika santrifüjleyin. Süspansiyon tutma kolonuna 125 mikrolitre sindirim tamponu ekleyin ve buharlaşmayı önlemek için kapağını kapatın. Numuneyi 37 santigrat derecede 18 saat çalkalamadan inkübe edin.

Şimdi, süspansiyon yakalama kolonuna 80 mikrolitre elüsyon tamponu bir ekleyin ve 1.25 dakika boyunca 4.000 G'de santrifüjleyin. Ayrıştırılmış peptitleri çekin ve temiz yeni bir tüpe aktarın. Peptit miktar tayininden sonra, 20 mikrogram peptidi liyofilize edin.

Liyofilize peptitleri% 0.1 formik asit suyunda% 3 asetonitril içeren 40 mikrolitre sulu tamponda yeniden çözün ve bir sonikasyon banyosunda 10 dakika boyunca sonikat yapın. Numuneyi 60 dakika boyunca 16.000 G'de santrifüjleyin ve süpernatanı kütle spektrometresi analizi için şişelere aktarın. Nano-sıvı kromatografi kütle spektrometresi sisteminin otomatik örnekleyicisini kullanarak her numuneden iki mikrolitre enjekte edin.

Dakikada 100 nanolitrede beş ila 35% asetonitril arasında 127 dakikalık bir gradyan kullanarak üç mikrometre C18 malzemesi ile paketlenmiş ters faz sütunu üzerinde ayrı peptitler. Peptitleri bir nanosprey iyon kaynağı aracılığıyla iyonize edin ve bunları Orbitrap tabanlı bir kütle spektrometresine aktarın. Dar aralıklı veriden bağımsız bir edinim yöntemi kullanarak peptitleri analiz edin.

FFPE doku işleme sırasında hassas ilgi alanı izolasyonu, farklı pankreatik kistik formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokular arasında elde edildi. Her bir pankreatik kistik neoplazm tipi için biyolojik tripreplikatlar arasında tekrarlanabilir toplam iyon kromatogramları elde edildi. Sıvı kromatografi kütle spektrometresi analizi 9.703 protein tanımladı.

Tanımlanan tüm proteinlerin bolluğu, kapsamlı proteom kapsamını gösteren 6.25 büyüklük sırasını kapsıyordu ve bilinen pankreas kanseri protein belirteçleri ölçüldü. İntraduktal papiller müsinöz neoplazmlarda 457 yukarı regüle ve 476 aşağı regüle olmak üzere toplam 933 diferansiyel olarak eksprese edilen protein tanımlandı. Biyoinformatik analiz, diferansiyel olarak eksprese edilen proteinlerin pankreas kanseri ile ilgili çeşitli yolaklarla ilişkili olduğunu ortaya koydu.