Frajil X Messenger Ribonükleoproteinden Yoksun İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Astrositlerin Üretimi ve Karakterizasyonu

Bu çalışma, beyne özgü dört insan astrositine ve bunların frajil X sendromu gibi nörogelişimsel bozukluklar tarafından nasıl değiştirildiğine odaklanmaktadır. Daha önceki çalışmalarda çoğunlukla nöronları incelemek için hayvan modelleri kullanılıyordu, bu nedenle bu çalışma bu araştırma alanına yeni bir boyut katıyor.

Hayvan çalışmalarından elde edilen mekanik içgörüler sınırlı klinik başarı ile bir araya gelmiştir. En büyük zorluk, insan kaynaklı nöronlar ve astrositler hakkında benzer bilgiler elde etmektir.

Protokolümüz, frajil X sendromunda düzensiz, glikolitik ve mitokondriyal metabolizma sergileyen rüzgara özgü astrositler için başarılı bir şekilde işlevsel hale getirildi ve glial hücrelerin hastalık biyolojisindeki rolünün araştırılmasını sağladı. Glialin sağlık ve hastalıktaki nöronal fonksiyondaki kilit rolüne dair artan kanıtlara rağmen, insan astrositlerinin frajil X sendromu gibi nörogelişimsel bozukluklarda nasıl etkilendiği hakkında çok az şey bilinmektedir.

İleriye baktığımızda, astrositlerin ve nöronlarla etkileşimlerinin hastalık tarafından nasıl değiştirildiğini ve daha sonra bunların terapötik müdahalelerle nasıl düzeltilebileceğini incelemek için bu çerçeveyi geliştireceğiz.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, gelişmiş DMMF 12'de bir ila 60 oranında seyreltilmiş altı şişirme kabını Matrigel ile kaplayın. Kaplanmış kabı iki ila sekiz santigrat derece arasında bir sıcaklıkta saklayın. Kültür gününde, kaplama malzemesini tabaktan çıkarın ve bir X'lik son konsantrasyonda bir kaya inhibitörü ile birlikte bir mililitre tam esansiyel sekiz ortam ekleyin. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücreleri veya IPSC'leri eklemeden önce% 5 karbondioksit ile 37 santigrat dereceye ayarlayın. Koloni aderansını artırmak için insan IPSC'lerini, kaya inhibitörü ile bir X'lik son konsantrasyonda tam bir esansiyel sekiz ortamda tohumlayın. Ertesi gün, tam esansiyel sekiz besiyerini, kaya inhibitörü içermeyen taze besiyeri ile değiştirin. Hücreler yaklaşık dört ila beş gün süren% 80 birleşmeye ulaşana kadar ortamı günlük olarak yenilemeye devam edin. Koloniler% 80 birleşmeye ulaştığında, bir kollajenaz karışımı ekleyin ve onları enzimatik olarak tabaktan ayırmak için boşaltın. Koloniler kalkmaya başladığında, tabağı inkübatörden çıkarın ve enzim aktivitesini nötralize etmek için iki mililitre DPBS ekleyin. DPBS kullanarak, kolonileri kazıyın ve süspansiyonu geniş bir tahta 10 mililitre serolojik pipet kullanarak 15 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Daha sonra, 10 mililitrelik bir serolojik pipetle, kolonileri parçalamak için süspansiyonu iki ila üç kez hafifçe ezin. Kolonilerin yerleşmesine izin verin. Yaklaşık iki dakika sonra, tüpte yaklaşık bir mililitre sıvı bırakırken DPBS enzim karışımını aspire edin. Daha sonra tüpe iki mililitre DPBS ekleyin ve kolonileri yeniden askıya almak için hafifçe vurarak karıştırın. Yerleşmelerine izin verin ve artık enzimi çıkarmak için bu işlemi iki kez tekrarlayın. Süpernatanı çıkardıktan sonra, kolonileri bir mililitre tam esansiyel sekiz besiyerinde yeniden süspanse edin ve taze hazırlanmış Matrigel kaplı bir tabağa koyun. Daha önce tarif edildiği gibi insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri enzimatik olarak kaldırın. Bunları, kimyasal olarak tanımlanmış bir ortama sahip, yapışmayan 100 milimetrelik bir süspansiyon kültür kabına yerleştirin. Hücre süspansiyonunu, kortiko kürelerinin gelişimini kolaylaştırmak için normoksik koşullar altında yedi gün boyunca dakikada 40 devirde bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Sekizinci günde, kortiko kürelerini bir hücre proliferasyon ortamına aktarın ve yedi gün boyunca koruyun. Glial spesifikasyonu indüklemek için, erken glia küreleri elde etmek için cortico kürelerini glial zenginleştirme ortamında iki hafta boyunca inkübe edin. Erken glia kürelerinin olgunlaşması için, temel fibroblast büyüme faktörü H'yi mililitre lösemi inhibitör faktörü başına 20 nanogram ile değiştirin ve küreleri dört hafta boyunca koruyun.

Olgunlaşma ortamında dört hafta geçirdikten sonra, küreleri uzun süre glial zenginleştirme ortamında tutmaya devam edin. Topaklanmayı ve canlılık kaybını önlemek için, steril bir endüstriyel bıçak kullanarak glia kürelerini her iki haftada bir mekanik olarak doğrayın. Doğrama işleminden kaynaklanan DNA parçalarını çıkarmak için tüm ortamı DNaz ile değiştirin. Daha sonra, bir papain ayrışma kiti kullanarak glia kürelerini astrosit progenitör hücrelerin mono katmanlarına ayırın. Ayrışmış hücreleri bir hücre kültürü üzerine plakalayın, bir ila 80 seyreltmede Matrigel ile önceden kaplanmış yapışkan bir kap muamele edin. Astrosit progenitör hücrelerini% 80 birleşmeye ulaşana kadar glial zenginleştirme ortamında çoğaltın. Hücrelerin geçişi, harcanan ortamı uzaklaştırır ve konik bir tüpte toplar. Hücrelere enzim hücre ayrılma ortamı ekleyin ve bir ila iki dakika bekleyin. Hücreler ayrılmaya başladığında, enzim aktivitesini nötralize etmek için harcanan ortamı ekleyin. Hücre süspansiyonunu toplayın ve iki dakika boyunca 800 G'de santrifüjleyin. Süpernatanı attıktan sonra, hücreleri glial zenginleştirme ortamında yeniden askıya alın. Matrigel kaplı bir tabağa bir ila 80 seyreltmede oyuk başına yaklaşık 10 ila altı hücre gücünde plaka koyun. Kriyo-koruma için, hücre peletini %90 cortico küre proliferasyon ortamı ve %10 kriyoprotektan oluşan soğuk bir karışımda yeniden süspanse edin. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri kriyo şişelerine aktarın. Kriyo şişelerini hemen bir kriyo kutusuna taşıyın ve gece boyunca eksi 80 santigrat derecede bir dondurucuda saklayın. Ertesi gün, tüm kriyo şişelerini uzun süreli saklama için sıvı bir nitrojen tankına aktarın. Ayrışmış astrosit progenitör hücreleri, Vimenton ve nükleer faktör IAM belirteçleri ile immün boyama ile karakterize edin. İnsan IPSC'den türetilmiş APC'lerin dört beyin bölgesel özgüllüğünü doğrulamak için, insan çatal kafa kutusu G1 ve insan homeo kutusu, B4 için gerçek zamanlı QPCR analizi gerçekleştirin. APC'leri 14 gün boyunca astrositlere ve astrositik farklılaşma ortamına ayırın. Adenozin beş tri fosfata tepkilerini ölçmek için tabak başına üç hücrenin gücüne beş çarpı 10 yoğunlukta 35 milimetrelik bir cam tabanlı tabak üzerine plaka astrositleri. Hücrelerin 24 saat boyunca cam tabana yapışmasına izin verin. Yapışan hücreleri kalsiyumsuz Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi ile üç kez yıkayın. Daha sonra hücreleri, oda sıcaklığında bir saat boyunca beş mikromolar oranlı metrik diüreyit 2:00 ve% 0.02 pluronik F127 içeren kültür ortamında inkübe edin. Hücreleri iki kez kültür ortamı ile yıkadıktan sonra, ortamı Hank'in Dengeli Tuz çözeltisi içeren iki milimolar kalsiyum ile değiştirin. Odaklanmış bir kaymayı dengeleyen ters çevrilmiş mikroskopta 60X yağa daldırma objektifi kullanarak hücreleri saniyede iki kare hızında görüntüleyin. Son olarak, 25 saniye işaretinde beş milimolar nihai konsantrasyonda ATP eklendikten sonra ATP'nin neden olduğu kalsiyum yanıtlarını kaydedin. İnsan IPSC kolonileri, immün boyama ile doğrulandığı gibi pluripotent belirteçler opt four ve nano eksprese etti. Frajil X sendromu ve kontrol hatlarından türetilen APC'ler, karşılaştırılabilir oranlarda vimentin ve NFIA pozitif hücreler gösterdi. Hem kontrol hem de kırılgan X sendromu insan kaynaklı pluripotent kök hücrelerden elde edilen astrosit progenitör hücreleri, HOXB4'e kıyasla Fox G1'in yukarı regülasyonunu sergiledi ve bu da bir ön beyin kimliğini gösterdi. İnsan IPSC frajil X sendromu çizgilerinden türetilen astrositler, azalmış sayıda GFAP ekspresyonu gösterdi. Kontrol ve frajil X sendromu astrositleri ATP'nin neden olduğu kalsiyum geçişleri sergiledi, ancak frajil X sendromu astrositlerinde yanıt verenlerin sayısı anlamlı olarak daha düşüktü. İlk ATP ile uyarılmış kalsiyum geçişinin tepe genliği, frajil X sendromu astrositlerinde kontrol hücrelerine kıyasla önemli ölçüde daha düşüktü. İnsan IPSC kaynaklı frajil X sendromu astrositleri glikoliz, glikolitik kapasite ve glikolitik rezervlerde bir artış gösterdi, ancak kontrol astrositlerine kıyasla maksimal solunumda önemli bir azalma gösterdi.