Name: Plazmid DNA Transfeksiyonu ve mRNA Nükleofeksiyon Dağıtımı Kullanılarak İnsan Hücrelerinde CRISPR Epigenom Düzenleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Öğrenin, insan hücrelerinde plazmid DNA transfeksiyonu ve mRNA nükleofeksiyonu kullanarak toksik DNA kırıkları olmadan CRISPR epigenom düzenleme yöntemlerini. Bu protokol, gen ifadesi modülasyonu için güvenli ve etkili bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Vücudumuzdaki her hücrenin genomik içeriği neredeyse aynı olsa da, her hücre tipinin transkripsiyonel profili büyük ölçüde farklılık gösterir. DNA ve histon proteinleri üzerindeki epigenetik modifikasyonlar, transkripsiyonel ekspresyonun anahtar düzenleyicileridir. Transkripsiyonel olarak aktif ökromatin, kompakt, transkripsiyonel olarak aktif olmayan heterokromatine kıyasla farklı epigenetik işaretlerle ayırt edilir. Örneğin, heterokromatik bölgeler, histon 3'ün (H3K9me3) lizin 9'u üzerinde trimetilasyon, histon H3'ün (H3K27me3) lizin 27'si üzerinde trimetilasyon ve gen promotörleri1'de guaninlerin (CpG) yanındaki sitozinler üzerinde DNA metilasyonu dahil olmak üzere baskılayıcı histon modifikasyonları ile tanımlanır. Aktif gen ekspresyonunun genomik bölgeleri, tipik olarak histon 3'ün (H3K4me3)1 lizin 4'ü üzerinde histon asetilasyonu ve trimetilasyonu ile tanımlanır.
Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR) devrimi, genomik dizilerin programlanmış olarak değiştirilmesini sağlayan çok sayıda araç üretmiştir. CRISPR teknolojisi, programlanabilir hedef dizilerde nükleik asitleri parçalayabilen prokaryotik bir savunma mekanizmasına dayanmaktadır. CRISPR nükleazları 2,3,4, baz düzenleyiciler 5,6 ve asal düzenleyiciler 7,8, DNA kesimi ve bu kırılmaların onarımı yoluyla memeli genomlarının DNA dizisini değiştirebilir. Etkili olmasına rağmen, bu stratejiler hedef dışı bölgelerdeDNA kırılmalarına 9,10 ve büyük ölçekli genomik yapısal mutasyonlara 11,12,13,14,15 neden olabilir. Alternatif CRISPR tabanlı araçlar, altta yatan DNA dizisini değiştirmeden gen aktivasyonunun ve baskılanmasının izlenebilir modülasyonunu sağlar. Bu araçlar, kromatin manzarasını 16,17,18 değiştiren efektör proteinlerle kombinasyon halinde, sgRNA dizisi tarafından dikte edilen hedef bölgelerde DNA bağlanmasına izin veren bir nükleaz eksikliği olan Cas9'u (dCas9) kullanır. Epigenetik yazarlar, okuyucular ve silgiler gibi efektör proteinler doğrudan dCas9'a kaynaştırılabilir veya SunTag gibi dCas9'a kaynaşmış bir peptit iskelesi veya MS2-MCP sistemi 16,17,18 gibi sgRNA üzerindeki bir RNA iskelesi tarafından işe alınabilir. Programlanabilir transkripsiyon kontrol araçlarına örnek olarak CRISPR aktivasyonu (CRISPRa)19,20,21 ve CRISPR girişimi (CRISPRi)22,23 verilebilir. CRISPRa, transkripsiyon mekanizmasını doğrudan işe alarak, hedef transkripsiyonel gen ekspresyonunu artırarakçalışır 19. Buna karşılık, CRISPRi, baskılayıcı bir epigenetik işaret22 olan H3K9me3'ü kurarak transkripsiyonu baskılar.
Epigenom düzenlemedeki ilerlemeler, bu araçların bilimsel alanlarda geniş çapta kullanılmasını sağlamıştır. Farklı efektör alanların ve proteinlerin füzyonları, mevcut epigenom düzenleyicilerinin araç setini genişletti 18,24,25,26,27,28,29,30. Ek olarak, epigenom editörleri, epigenetik modifikasyonların(31,32,33,34,35,36), efektörlerin 37,38,39 ve efektör mutasyonların 28,40,41 rollerini deşifre etmek için kullanılır gen regülasyonunda. Spesifik olarak, CRISPRi ve CRISPRa, hücre sağkalımı42 ve hücre kaderi 43,44,45,46,47 dahil olmak üzere çeşitli biyolojik süreçler için fonksiyonel genomik ekranlarda kullanılır. Ayrıca, epigenom düzenleme, ex vivo hücre mühendisliği ve in vivo tedaviler için terapötik potansiyele sahiptir18.
Burada, insan hücre hatlarında programlanabilir transkripsiyonel baskılama için iki dCas9 tabanlı epigenom düzenleyicisinin uygulanma yöntemlerini açıklıyoruz: CRISPRi22 ve CRISPRoff48. CRISPRi, ZNF10 (KOX1) ve ZIM322,23 gibi bir çinko parmak proteininden baskıcı KRAB alanına dCas9'un bir füzyonudur. CRISPRi belirli bir gen promotörüne hedeflendiğinde, KRAB alanı, hedef geni baskılamak için bir H3K9me3 yazarı olan SETDB1'i işe alır (Şekil 1A). CRISPRi geçici olarak eksprese edildiğinde, hedef lokusta kurulan H3K9me3 korunmaz ve gen ekspresyonu zamanla geri yüklenir32,48. Fonksiyonel genomik uygulamalarda olduğu gibi CRISPRi kullanarak kararlı knockdown'lar yapmak için, sgRNA ile birlikte hücrelerde CRISPRi'nin yapısal ekspresyonu esastır. Son zamanlarda, CRISPRoff kalıtsal epigenom düzenleme48'i programlamak için tasarlandı. CRISPRoff, dCas9'un KRAB alanına ve de novo DNA metiltransferaz kompleksine, DNMT3A ve DNMT3L'ye tek bir protein füzyonudur. İnsan hücrelerinde geçici bir CRISPRoff darbesi, hedeflenen genlerde H3K9me3 ve DNA metilasyonunun birikmesini programlar, bu da DNA metilasyonu ve H3K9me3'ün sürdürülmesiyle hedef genlerin uzun süreli baskılanmasına yol açar (Şekil 1B)48. Ayrıca, epigenom düzenlemeleri tersine çevrilebilir. Örneğin, CRISPRoff tarafından kararlı bir şekilde susturulan bir gen, hedef lokus49'daki DNA metilasyon işaretlerini enzimatik olarak çıkarabilen TET1-dCas9 tarafından yeniden aktive edilebilir.
Bu protokol, epigenom editörlerinin geçici ekspresyonu için iki dağıtım yöntemini detaylandıracaktır: plazmid DNA transfeksiyonu ve mRNA nükleofeksiyonu. Ek olarak, CLTA ve CD55 olmak üzere iki endojen gende epigenom düzenleme etkinliğini değerlendirmek için akış sitometrisinin nasıl kullanılacağını ana hatlarıyla açıklıyoruz. Bu yöntemler, ek düzenleyiciler kullanılarak diğer epigenom düzenleme deneylerine uyarlanabilir ve uygulanabilir veya farklı genleri hedeflemek için kullanılabilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68089/68089fig01.jpg"> 
Şekil 1: CRISPRi ve CRISPRoff epigenom düzenleme mekanizması ve iş akışı şeması. (A) sgRNA transgeni ve CRISPRi epigenom düzenleyicisinin doğrusal şemaları. CRISPRi ve sgRNA'nın eklenmesi, hedef lokusu susturmak için baskılayıcı H3K9me3 histon işaretinin eklenmesine izin verir. En yüksek susturma seviyesi, CRISPRi ilavesinden sonra erken elde edilir ve gen hedefi genellikle birkaç geçişten sonra yeniden aktive edilir. (B) sgRNA transgeninin ve CRISPRoff epigenom editörünün doğrusal şemaları. İLGILENILEN bir geni hedef alan hücrelere CRISPRoff eklenmesi, hedef geni susturmak için CpG bölgelerinde DNA metilasyonu ile birlikte baskılayıcı H3K9me3'ün eklenmesine yol açar. CRISPRoff ile susturma kalıtsaldır - yüksek düzeyde susturma, transfeksiyon sırasında erken elde edilir ve çoklu hücre bölünmeleri boyunca devam eder. (C) Transfeksiyon yöntemiyle epigenom düzenleme için zaman çizelgesine genel bakış. 0. günde, hücreler transfeksiyon için kaplanır. 1. günde, düzenleyici ve kılavuz plazmit, transfeksiyon yoluyla hücrelere verilebilir. 3. günde, hücreler akış sitometrisi yoluyla BFP ekspresyonu açısından değerlendirilecektir. BFP'nin yüzdesi, her koşul için deneyin nihai susturma etkinliğini belirlemek için normalleştirici bir faktör olarak kullanılır. 6. günden itibaren, hücreler ilgili muhabiri susturmak için analiz edilir, çünkü bu gün en yüksek susturma seviyesine ulaşılacaktır. (D) Epigenom editörü ve sgRNA plazmitlerinin hücrelere damla damla eklendiği transfeksiyon yöntemine genel bakış. (E) Nükleofeksiyon yöntemleri aracılığıyla epigenom düzenleme zaman çizelgesine genel bakış. Bu protokolde mRNA, 0. günde hücrelere nükleofeksiyondur. Hücreler, akış sitometrisi analizi kullanılarak nükleofeksiyondan sonraki 3. günde susturma açısından değerlendirilir. (F) Nükleofeksiyon protokolüne genel bakış. Uygun miktarlarda hücre ve mRNA karıştırılır ve nükleofektör küvetlerine eklenir. sgRNA nükleofeksiyon ile eklenirse, bu karışıma da eklenebilir. Küvetler nükleofektöre konur ve mRNA'yı hücrelere sokmak için uygun darbe kodları kullanılır. Nükleofeksiyon sonrası, hücreler kaplanır ve daha sonraki günlerde analiz için geçirilir. (G) Epigenom düzenleme için plazmit transfeksiyonu ve mRNA nükleofeksiyon stratejileri arasında karşılaştırma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68089/68089fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table><tbody><tr><td>4D-Nükleofektör</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu doku kültürü plakaları</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>96 oyuklu U-alt Plaka</td><td>Corning</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-insan CD55 Antikoru BioLegend</td><td></td><td>311312</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A1 Akış Sitometresi</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır</td><td>Suyu Waxie</td><td></td><td></td></tr><tr><td>11003428432 Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>Kontes Otomatik Hücre Sayacı</td><td>Thermo Scientific</td><td>Kontes 3</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRoff transfeksiyon plazmidi</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>167981</tr><tr><td>Akış Sitometrisi için Seyreltici 2 Hematoloji Reaktifi (Kılıf sıvısı)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-029-361</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, Yüksek Glikoz</td><td>Thermo Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf tüpleri</td><td>Thomas bilimsel</td><td>1159M35</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville&nbsp; SF Hücre Hattı 4D-Nükleofektör X Kiti L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0281111</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE&trade; T7 ULTRA Transkripsiyon Kiti</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>PCR şerit tüpleri</td><td>USA Scientific&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-Streptomisin-Glutamin</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>pLG1 sgRNA ekspresyonu plazmidi</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>217306</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22-400-105</td><td></td></tr><tr><td>SF Hücre Hattı 96 oyuklu Nükleofektör&reg; &nbsp; Kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>Doku kültürü inkübatörü</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUVDL-PA</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI transfeksiyon reaktifi</td><td>Mirus</td><td>MIR 2306</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin-EDTA (% 0.25)</td> <td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr></tbody></table>

plazmid dna transfeksiyonu ve mrna nükleofeksiyon dağıtımı kullanılarak İnsan hücrelerinde crispr epigenom düzenleme

CRISPR Epigenome Editing in Human Cells using Plasmid DNA Transfection and mRNA Nucleofection Delivery

Tüm epigenom düzenleme deneyleri için, epigenom düzenleme verimliliğini değerlendirmek için uygun kontroller kritik öneme sahiptir. İnsan genomundaki herhangi bir diziyi hedeflemeyen bir kontrol sgRNA'sı kullanmanızı öneririz. Hedeflemeyen bir kılavuz kontrolünün kullanılması, hedef lokuslardaki değişikliklerin, yalnızca epigenom düzenleyicisinin aşırı ekspresyonu veya spesifik olmayan bağlanmasından ziyade, epigenom düzenleyicisinin o bölgeye yönlendirilmesi tarafından yönlendirildiğine dair güven verecektir. Ek olarak,...

Plazmid DNA Transfeksiyonu ve mRNA Nükleofeksiyon Dağıtımı Kullanılarak İnsan Hücrelerinde CRISPR Epigenom Düzenleme

Epigenetics refers to chemical modifications of histone proteins and DNA that can regulate the expression of genes. The human epigenome is altered ...

crispr-epigenome-editing-human-cells-using-plasmid-dna-transfection

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Bu video, insan pluripotent kök hücrelerinde (hPSC'ler) çinko parmak nükleaz tabanlı genom düzenleme tekniğini göstermektedir. hPSC'ler potansiyel olarak çeşitli hücre tiplerine ayrılabildiğinden, bu teknoloji hastaya özgü bir şekilde in vitro patolojik ve farmakolojik çalışmalar için yararlıdır.

Çinko Parmak Nükleaz Tabanlı Genom Düzenleme: İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde Çift Sarmallı Homoloji Bağımlı Onarım Mekanizması ile Genomu Değiştirme Tekniği

İnsan pluripotent kök hücrelerinin (hPSC'ler) genom düzenlemesi hızlı ve verimli bir şekilde yapılabilir. Burada, EGFP'yi eksprese etmek ve antibiyotik direncini ortaya çıkarmak için AAVS1 güvenli liman lokusunun düzenlenmesiyle örneklendiği gibi, hPSC'leri genetik olarak tasarlamak için sağlam bir deneysel prosedür sunulmaktadır.

Genom düzenlenmiş İnsan Pluripotent Kök Hücre Hatları oluşturulması: İzolasyon hedefleyen Gönderen

Bu iletişim kuralı iş akışı sistemi onarıma memeli hücrelerinde noktası mutasyonların düzenleme CRISPR/Cas9-tabanlı bir gen özetliyor. Burada, gen Indel oluşumu hedef sitesindeki ölçmek için detaylı bir follow-on deneysel stratejisi ile düzenleme bir Kombinatorik yaklaşım kullanın — özünde, yerinde mutagenesis analiz.

Yerinde mutagenisitesinin CRISPR/Cas9 ve SsODN insan hücrelerinde tarafından katalize nokta mutasyon onarım bir fonksiyonu olarak incelemek için standart bir metodoloji

Preassembled Cas9 kullanan karmaşık Ribonükleoprotein (RNP) kesin, verimli genom düzenleme için güçlü bir yöntemdir. Burada, biz yararını hücreleri ve organizmalar, geniş aralığında birincil insan hücreleri ve her iki klasik de dahil olmak üzere ve model organizmalar gelişmekte olan vurgulayın.

Gelişmiş genom Cas9 Ribonükleoprotein yılında çeşitli ile hücreleri ve organizmaların düzenleme

CRISPR-Cas bitki ve hayvan karmaşık genleri Mühendisi için güçlü bir teknolojidir. Burada, verimli bir şekilde farklı Cas endonucleases kullanarak insan genomu düzenlemek için bir iletişim kuralı ayrıntılı. Biz ilgili önemli noktalar ve Düzenleme verimliliği optimize etmek için tasarım parametreleri vurgulayın.

Memeli hücre CRISPR-Cas kullanarak satırları genom düzenleme

DNA epigenome temsil düzenleme güçlü bir tedavi yaklaşımı hedef. Bu iletişim kuralı üretim, arıtma ve toplama tüm-içinde-bir lentiviral vektörlerin İnsan İndüklenmiş pluripotent kök hücre (hiPSC)'epigenome düzenleme uygulamaları için CRISPR-dCas9-DNMT3A transgene yataklık açıklar-nöronlar türetilmiş.

Pluripotent kök hücre kaynaklı hastalık modelleri lentiviral vektör platformu için Epigenome düzenleme araçları verimli bir şekilde teslim insan içine indüklenen

Burada sunulan verimli CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein aracılı gen düzenleme meme hücrelerinde tüp Elektroporasyon kullanarak bir protokoldür.

CRISPR/Cas9 ribonucleoprotein-boru Elektroporasyon tarafından aracılı hassas gen düzenleme

Bu protokol, insan pluripotent kök hücrelerinde CRISPR-CAS9 kullanılarak tanımlanmış heterozigot veya homozigot nükleotid değişikliklerinin oluşumunu kolaylaştıracak bir yöntem sağlar.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinde CRISPR-CAS9 Kullanılarak Tanımlanmış Genomik Modifikasyonların Üretimi

Burada, piggyBac bazlı bir donör plazmid ve Cas9 nickaz mutantı kullanarak insan pluripotent kök hücrelerinde dikişsiz gen düzenleme için ayrıntılı bir yöntem açıklıyoruz. İnsan embriyonik kök hücrelerinde (hESC'ler) hepatosit nükleer faktör 4 alfa (HNF4α) lokusunun ekzon 8'ine iki nokta mutasyonu getirildi.

Kesintisiz Genom Düzenleme Kullanarak İnsan Pluripotent Kök Hücrelerine Nokta Mutasyonlarının Tanıtılması

Genom editörlerinin RNA olarak sunulması, birincil memeli hücrelerinin ve hücre hatlarının genomlarını değiştirmek için özellikle güçlü bir yöntemdir. Bu protokolün amacı, genom düzenleyicilerini mRNA olarak birincil memeli hücrelerine ve hücre hatlarına göndermek, ardından düzenleme sonuçlarını nicelendirmek için hedefli Illumina dizileme ve analizi yapmaktır.

Birincil memeli hücrelerinde editör RNA'nın elektroporasyonu yoluyla genom düzenlemesi

Öğrenin, insan hücrelerinde plazmid DNA transfeksiyonu ve mRNA nükleofeksiyonu kullanarak toksik DNA kırıkları olmadan CRISPR epigenom düzenleme yöntemlerini. Bu protokol, gen ifadesi modülasyonu için güvenli ve etkili bir yaklaşım sunar.

Plazmid DNA Transfeksiyonu ve mRNA Nükleofeksiyon Dağıtımı Kullanılarak İnsan Hücrelerinde CRISPR Epigenom Düzenleme

Daha fazla video keşfet