Akciğer Retinoid İçeren Hücrelerin Hücre Ayıklama ile İzolasyonu

Araştırmamız, yetişkin akciğerinin fonksiyonel sağlığının korunmasında A vitamini ve metabolitlerinin, topluca retinoidler olarak adlandırılan fizyolojik rolünü anlamaya odaklanmaktadır.

Akciğerin son derece özelleşmiş ve heterojen hücresel bileşimi nedeniyle, akciğer sağlığı ve hastalığında retinoid aracılı hücresel iletişimi incelemek için spesifik hücre etiketleme, sıralama ve dizileme gibi tek hücreli teknikler gereklidir.

Araştırmamız, yetişkin akciğerinde retinoid metabolizmasının ve sinyalizasyonunun daha önce şüphelenilemeyen karmaşıklığını ve yaralanmalar sırasında akciğeri korumadaki kritik rolünü ortaya çıkardı.

Protokolümüz, endojen retinoid otofloresansa dayalı olarak spesifik akciğer hücresi popülasyonlarının izolasyonunu sağlar ve tüm floresan protein ekspresyonunda florokrom konjuge antikor boyası ile kolayca entegre edilebilir.

Çalışmalarımız, A vitamini metabolizmasının mekanizmalarını ve etkilerini anlamak için paradigma değiştiriyor. Bu çalışmaların sonuçları, akciğer hastalığını hafifletmeyi amaçlayan beslenme müdahaleleri de dahil olmak üzere mevcut stratejileri etkileyebilir ve etkileyecektir.

[Sunucu] Başlamak için, bilinç kaybı seviyesini kontrol etmek için anestezi uygulanmış bir fare üzerinde ayak parmağı sıkıştırma testini gerçekleştirin. Ameliyat bölgesindeki gevşek tüyleri ve görünür kirleri temizleyin. Ardından, dezenfeksiyon için %70 alkol kullanarak alanı silerek temizleyin. Steril cerrahi aletler kullanarak karın ve göğüs boşluklarını açın. Akciğerleri ve kalbi ortaya çıkarmak için kaburgaları ve diyaframı kesin. Ardından, inferior vena kava'yı kesin. Salınan kanı emmek için emici bir ped uygulayın. Kalsiyum ve magnezyum içermeyen 5 mililitre steril HBSS ile kalbin sağ ventrikülünden akciğerleri yerinde perfüze edin. Akciğer dokusunun beyazlaştığını gözlemleyerek başarılı perfüzyonu doğrulayın. Enzimler, kalsiyum ve magnezyum içeren steril HBSS ile doldurulmuş 10 mililitrelik başka bir şırınga kullanarak akciğerleri tekrar perfüze edin. Şimdi, akciğerleri çıkarın ve bunları kalsiyum ve magnezyum içeren 2 mililitre steril HBSS içeren bir hücre kültürü kabına aktarın. Laminer bir başlık altında, akciğerleri durulayın ve steril bir cerrahi bıçakla küçük parçalar halinde kıyın. Kıyılmış akciğerlere kalsiyum ve magnezyum içeren 5 mililitre HBSS enzimi ekleyin. Ardından, süspansiyonu 15 mililitrelik bir tüpe aktarmak için 10 mililitrelik bir serolojik pipet kullanın. Hücre kültürü kabını HBSS içeren 5 mililitre enzim ile yıkayın. Yıkama solüsyonunu 15 mililitrelik tüpe aktarın. HBSS içeren enzimdeki kıyılmış akciğer dokusunu 37 santigrat derecede dönen bir çalkalayıcı üzerinde 45 dakika inkübe edin. Her 15 dakikada bir, ayrışmayı arttırmak için kıyılmış dokuyu laminer başlığın içindeki 10 mililitrelik serolojik pipetten 10 kez pipetleyin. Bunu üç kez yapın. Elde edilen hücre süspansiyonunu 100 mikrometrelik bir süzgeçten geçirerek% 5'ten daha az FBS içeren 20 mililitre soğuk canlı hücre görüntüleme çözeltisi içeren 50 mililitrelik bir tüpe geçirin. Hücreleri 500 g'da 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire ettikten sonra, hücre peletini 1 mililitre kırmızı kan hücresi parçalama tamponunda yeniden süspanse edin ve inkübe edin. Eritrositler parçalandığında, tekrar santrifüjlemeden önce süspansiyona 20 mililitre soğuk canlı hücre görüntüleme solüsyonu ekleyin. Süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 20 mililitre soğuk canlı hücre görüntüleme solüsyonunda yeniden süspanse edin. Elde edilen hücre süspansiyonunu 40 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirerek 20 mililitre soğuk canlı hücre görüntüleme solüsyonu içeren 50 mililitrelik bir tüpe geçirin. Hücreleri toplamak için hücre süspansiyonunu daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Son olarak, süpernatanı aspire edin ve hücre peletini 10 mililitre soğuk canlı hücre görüntüleme solüsyonunda yeniden süspanse edin. Bir hemositometre kullanarak hücreleri mikroskop altında sayın ve konsantrasyonu mililitre başına yaklaşık 5 ila 10 milyon hücreye ayarlayın. Hazırlanan hücre süspansiyonunun bir kısmını alın ve lekesiz bir geçit kontrolü olarak bir kenara koyun. 30 nanomolar'lık bir nihai konsantrasyon elde etmek için kalan hücre süspansiyonuna 1 ila 1000 seyreltmede canlılık boyası sitoscreen ekleyin. Ardından, polistiren 5 mililitrelik bir toplama tüpüne bir filtre takın. Süspansiyonu filtreden geçirin. Canlı retinoid içeren hücreleri 455 nanometredeki emisyonlarına göre izole etmek için floresanla aktive edilen hücre sıralaması gerçekleştirin. İleri saçılma yüksekliğine karşı ileri saçılma alanı grafiği kullanarak sıralı tekli ayrım gerçekleştirin. Saçılma özelliklerine ve sitoekran boyamaya dayalı olarak ölü hücreleri hariç tutun. 350 nanometrede uyarılma üzerine 455 nanometredeki emisyonlarına dayalı olarak tek canlı retinoid içeren hücreleri kapılayın, sıralayın ve toplayın. Son olarak, akış sitometrisi yazılımını kullanarak FACS veri analizi gerçekleştirin. Akciğer hücresi süspansiyonları vahşi tip farelerde 455 nanometrede yüksek otofloresansa sahip farklı bir canlı tek hücre popülasyonu tespit edildi. Aynı otofloresan popülasyonu, Lrat nakavt akciğer hücresi süspansiyonlarında yoktu. TdTomato pozitif fibroblastların bir alt popülasyonu, Cre ile indüklenebilir bir etiketleme sistemi kullanılarak başarılı bir şekilde izole edildi ve retinoid içeren hücrelerin otofloresansa dayalı olarak bu hücre popülasyonundan daha fazla ayrılmasına izin verildi. tdTomato pozitif akciğer fibroblastlarının varlığı, kırmızı işaretli hücreleri gösteren floresan mikroskobu kullanılarak doğrulandı. Sıralanan fibroblastlardaki retinoid varlığı, retinol ve retinol esterleri tanımlayan HPLC kullanılarak doğrulandı. Retinoid içeren fibroblastlarda lipid damlacıkları tespit edildi.