Name: Wolbachia ile enfekte Drosophila melanogaster JW18 Hücre Hattından Monoklonal Kültürlerin Üretilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Öğrenin, Wolbachia ile enfekte Drosophila melanogaster JW18 hücre hattından monoklonal kültürler üretmeyi. Bu düşük maliyetli protokol, hücre stresini en aza indirerek tekrarlanabilir sonuçlar sağlar ve bakteri evrimini incelemede kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<table><tbody><tr><td>0.22 &mikro; m şırınga fliter&nbsp; &nbsp;</td><td>TPP'nin</td><td>99722</td><td>Steril</td></tr><tr><td>10x Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>70011044</td><td>Steril</td></tr><tr><td>12 veya 18 mm yuvarlak kapak camı&nbsp;</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tüpleri</td><td>Genoplast</td><td>601052</td><td>Steril</td></tr><tr><td>24 oyuklu plaka</td><td>SitoBir</td><td>CC7682-7524</td><td>Doku kültürü tedavi edildi</td></tr><tr><td>5 &mikro; m şırınga filtresi</td><td>Ne adam</td><td>10462000</td><td>Steril</td></tr><tr><td>6 oyuklu plaka</td><td>SitoBir</td><td>CC7682-7506 Serisi</td><td>Doku kültürü tedavi edildi</td></tr><tr><td>96 oyuklu plaka</td><td>SitoBir</td><td>CC7682-7596 Serisi</td><td>Doku kültürü tedavi edildi</td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>J66501.30</td><td></td></tr><tr><td>Hücre kültürü şişesi, 25 cm2</td><td>Greiner Biyo-on</td><td>391-3103</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Hücre kazıyıcılar&nbsp;</td><td>Greiner Biyo-on</td><td>391-3010</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Şeffaf oje&nbsp;</td><td>Herhangi bir marka</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CryoPure şişeleri</td><td>Sarstedt</td><td>72.379</td><td>Steril</td></tr><tr><td>DMSO, hücre kültürü derecesi</td><td>Merck</td><td>D2650-100ML</td><td>Steril</td></tr><tr><td>DreamTaq PCR Ana Karışımı</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>K1081 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>324503-100GM</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Elektroforez Güç Kaynağı</td><td>Merck</td><td>PS 251-2</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Yoğunlaştırıcı Artı</td><td>Merck</td><td>EP5305000509</td><td>Herhangi bir markanın vakum yoğunlaştırıcısı yerine kullanılabilir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Merck</td><td>1009861000</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M5000 Görüntüleme Sistemi</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>AMF5000</td><td>Klon ilerlemesini izlemek için herhangi bir markanın ters çevrilmiş mikroskobu kullanılabilir. BALIKLARI görselleştirmek için floresan mikroskop gereklidir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>Merck</td><td>F9665 Serisi</td><td>Isı ile inaktive edilmiş</td></tr><tr><td>Formaldehit&nbsp;</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>047377.9L</td><td></td></tr><tr><td>Formamid&nbsp;</td><td>Merck</td><td>F7503-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Jel elektroforez tankları</td><td>Balta Bilimsel</td><td>MSMIDI</td><td></td></tr><tr><td>Jel Görüntüleyici</td><td>BioRad</td><td>12009077</td><td>GelDoc Go Jel Görüntüleme Sistemi</td></tr><tr><td>GeneRuler 100 bp DNA Merdiveni</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>SM0243 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma Bloğu</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>88870005</td><td></td></tr><tr><td>Herasafe 2025 Sınıf II Biyolojik Güvenlik Kabini</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>51033314</td><td>Herhangi bir markanın biyolojik güvenlik dolabı, içinde steril bir ortam sağladığı sürece kullanılabilir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Hoechst 33342 Çözelti (20 mM) 5 mL</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>62249</td><td>Karanlıkta saklayın.</td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>Merck</td><td>258148-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Integra Biosciences Corp&nbsp; PIPETBOY acu 2 Pipet Yardımı</td><td>Fisher Bilimsel</td><td>NC0085686</td><td>Herhangi bir markanın serolojik pipet kontrol cihazı kullanılabilir.&nbsp;</td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Merck</td><td>I9516-1L</td><td></td></tr><tr><td>Laboratuvar dondurucu</td><td>&nbsp; Liebherr&nbsp;</td><td>LGUex 1500 MediLine</td><td>Sabit sıcaklığı koruyabilen herhangi bir dondurucu uygundur.&nbsp;</td></tr><tr><td>Sıvı nitrojen tankı</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>CY50985</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop slaytları</td><td>Merck</td><td>CLS294875X25-72EA</td><td></td></tr><tr><td>Moleküler dereceli su</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çok kanallı pipet</td><td>Eppendorf Belediyesi</td><td>3125000036</td><td></td></tr><tr><td>Nano damla</td><td>Peqlab</td><td>ND-1000 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Hemositometre</td><td>Merck</td><td>BR717810-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm&nbsp; M Sızdırmazlık Filmi</td><td>Merck</td><td>HS234526B-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Peltier soğutmalı inkübatör</td><td>Memmert</td><td>IPP55 artı</td><td>Sabit 25'i koruyabilen herhangi bir kuluçka makinesi var mı? C uygundur. JW18 hücre hattı veya klonları için CO2 kontrolü gerekmez.&nbsp;</td></tr><tr><td>Fenol/Kloroform/İzoamil alkol (25:24:1)</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>327115000</td><td></td></tr><tr><td>Pipet seti</td><td>Eppendorf Belediyesi</td><td>EP2231300008</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum asetat</td><td>Merck</td><td>P1190-500G</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Kuasar&nbsp; 670-etiketli 16s rRNA FISH prob&nbsp; ayarlamak</td><td>Biyoarama Teknolojileri</td><td></td><td>Özel yapım, probların sıraları Tablo 1'de bulunabilir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Soğutmalı MikroSantrifüj</td><td>Laboratuvar ağı</td><td>C2500-R Serisi</td><td></td></tr><tr><td>rpl32 primer ileri 5'-CCGCTTCAAGGGACAGTATC-3'</td><td>Eurofins genomiği</td><td></td><td>Makalede belirtilen referansa dayalı olarak özel olarak üretilmiştir</td></tr><tr><td>rpl32 primer ters 5'-CAATCTCCTTGCGCTTCTTG-3'</td><td>Eurofins genomiği</td><td></td><td>Makalede belirtilen referansa dayalı olarak özel olarak üretilmiştir</td></tr><tr><td>SDS</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>AM9823 Serisi</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Serolojik pipetler</td><td>Corning</td><td>357771</td><td></td></tr><tr><td>Shields ve Sang M3 Böcek Orta</td><td>Merck</td><td>S8398 Serisi</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH Hibridizasyon Tamponu&nbsp; &nbsp;</td><td>Biyoarama Teknolojileri</td><td>SMF-HB1-10 Serisi</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Stellaris RNA BALIK Yıkama Tamponu A&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biyoarama Teknolojileri</td><td>SMF-WA1-60 Serisi</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Stellaris RNA FISH Yıkama Tamponu B&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Biyoarama Teknolojileri</td><td>SMF-WB1-20</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Steril Reaktif Rezervuarları&nbsp;</td><td>ThermoFisher Bilimsel</td><td>8094</td><td>Steril</td></tr><tr><td>TAE tamponu</td><td>Merck</td><td>1061741000</td><td>1x&nbsp;</td></tr><tr><td>TE tampon&nbsp;</td><td>Merck</td><td>93283</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Termal döngüleyici</td><td>Syngen Biyoteknoloji</td><td>Termoblok 96</td><td>Herhangi bir markanın termal döngüleyicisi yerine kullanılabilir.&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris tabanı</td><td>Merck</td><td>10708976001</td><td>Steril</td></tr><tr><td>Ultra düşük sıcaklıklı dondurucu</td><td>PHC şirketi&nbsp;</td><td>MDF-DU502VH-PE</td><td>-80 ? C kullanılabilir.</td></tr><tr><td>Vectashield Montaj Orta&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Vektör Laboratuvarları</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>wsp primer ileri 5'-TGGTCCAATAAGTGATGAAGAAAC-3'</td><td>Eurofins genomiği</td><td></td><td>Makalede belirtilen referansa dayalı olarak özel olarak üretilmiştir</td></tr><tr><td>wsp primer ters 5'-AAAAATTAAACGCTACTCCA-3'</td><td>Eurofins genomiği</td><td></td><td>Makalede belirtilen referansa dayalı olarak özel olarak üretilmiştir</td></tr></tbody></table>

wolbachia ile enfekte drosophila melanogaster jw18 hücre hattından monoklonal kültürlerin Üretilmesi

Generation of Monoclonal Cultures from Wolbachia-infected Drosophila melanogaster JW18 Cell Line

Tek hücreli süspansiyon ve kaplamanın hazırlandığı günden (0. gün) sürekli hücre hatlarının oluşturulmasına (45. veya 77. gün, Şekil 2) kadar ışık mikroskobu ile monoklonal kültürlerin kurulması sürecini görselleştirdik. Hücre bölünmesinin ilk belirtileri, kuyucuk başına zaten dört hücre varken 3. günde (kaplamadan 4 gün sonra, kaplama 0. günde yapıldığı için) gözlenmiştir (Şekil 2). 14. günde, klonlar ya tek tabaka (JW18-B9, C7 ve E5) ya da geçiş sırasında bozulan bir küre (JW18-G4) olarak büyüdü. 28. günde, hücre hatları arasındaki büyümedeki farklılıklar en belirgindi. JW18-C7 kültürü 45. günde birleşirken, kalan klonal kültürler sadece 77. günde kuruldu. Ayrıca, hücre morfolojilerindeki farklılıkları yakalamak için kuruluştan 30 sonra dört farklı kültürü görselleştirdik (Şekil 3).
Monoklonal kültürlerin Wolbachia enfeksiyon durumunu belirlemek için PCR (Şekil 4) ve FISH (Şekil 5) uygulandı. Bir klon hariç hepsinin (JW18-C7), Wolbachia enfeksiyonunun göstergesi olan wsp geni için bir bant ürettiğini gözlemledik. FISH, PCR sonuçlarını doğruladı: JW18-B9, JW18-E5 ve JW18-G4 klonları Wolbachia enfeksiyonunu korurken, klon JW18-C7'de Wolbachia yoktu. Genel olarak, karışık bir JW18 hücre popülasyonundan, üçü orijinal Wolbachia enfeksiyonunu koruyan dört klonal kültür oluşturabildik. Ham verilere Figshare: https://figshare.com/s/15fde47ca7338f31dda9 adresinden erişilebilir.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig1.jpg"> 
Şekil 1: Monoklonal kültür üretimi için iş akışı. (A) 96 oyuklu plakadaki birincil ve ikincil seyreltmeler. (B) Seri seyreltme sonrası tek hücreler. (C-E) Hücrelerin çoğalmasında ilerleme ve sırasıyla 96 oyuktan 24 ve 6 oyuklu plakaya transfer. (F) 25cm2 hücre kültürü şişelerinde sürekli kültürler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig2.jpg"> 
Şekil 2: JW18 klonal hatlarının tek hücreden çok hücreli kültüre ilerlemesi. 0. günden (kaplama günü) 77. güne kadar, tüm çizgilerin 25cm2'lik bir hücre kültürü şişesinde başarıyla oluşturulduğu klonal çizgilerin parlak alan görüntüleri. Ölçek çubukları = 25 μm (gün 0), 50 μm (gün 3), 150 μm (gün 14), 300 μm (gün 28, 45, 77). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig3.jpg"> 
Şekil 3: Bireysel JW18 klonal çizgilerinin morfolojisi. Kuruluş sonrası 30. geçitte hücre morfolojilerini gösteren klonal çizgilerin parlak alan görüntüleri. Ölçek çubukları = 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig4.jpg"> 
Şekil 4: PCR ile incelenen klonal kültürlerin Wolbachia durumu. JW18 ebeveyn hücre hattında Wolbachia için PCR ve klonal hatlar JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5 ve JW18-G4'te kuruluş sonrası geçiş 11. Wolbachiawsp bandı Wolbachia'nın varlığını doğrularken, Drosophilarpl32 bandı bir DNA kalite kontrol PCR'sidir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68207/68207fig5.jpg"> 
Şekil 5: FISH ile incelenen klonal kültürlerin Wolbachia durumu.JW18 ebeveyn hücre hattı ve klonları JW18-B9, JW18-C7, JW18-E5, JW18-G4, kuruluş sonrası 13. geçişte FISH boyama ile görselleştirildi. Wolbachia, macenta içinde ayarlanmış Quasar 670 etiketli 16s rRNA Stellaris FISH probu ile boyanır ve nükleik asitler camgöbeği içinde Hoechst 33342 ile boyanır. Ölçek çubukları = 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/68207fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Tablo S1: Wolbachia w Mel 16S rDNA'ya karşı tasarlanmış oligonükleotid probları ve bunların Schneider ve ark. tarafından yayınlanan problarla karşılaştırılması.42. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68207/Table%20S1.%20Stellaris%20probe%20set%20_16052025.xlsx" target="_blank">Bu tabloyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Wolbachia ile enfekte Drosophila melanogaster JW18 Hücre Hattından Monoklonal Kültürlerin Üretilmesi

Cell lines are widely used models in biological research. They are particularly useful in studies of intracellular bacteria that cannot be efficiently ...

generation-monoclonal-cultures-from-wolbachia-infected-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Biz ayrı primer hücrelerin hazırlanması için ayrıntılı bir...

Birincil Hücre Kültürleri Drosophila Gastrula Embriyolar

Drosophila melanogaster, doğuştan gelen bağışıklık sistemlerini ve enfeksiyon ve hastalığın fizyolojik sonuçlarını incelemek için olağanüstü bir model organizmadır. Bu protokol, D. melanogaster'e sağlam ve kantitatif olarak tekrarlanabilir bakteriyel enfeksiyonların nasıl sağlanacağını ve daha sonra enfeksiyon şiddetinin nasıl ölçüleceğini ve konak immün yanıtının nasıl ölçüleceğini açıklar.

Sistemik Bakteriyel Enfeksiyon ve Bağışıklık Savunma FENOTİPİ içinde<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aksenik ve gnotobiyotik koşullarda Drosophila melanogaster yetiştirme için bir yöntem sunulmuştur. Fly embriyolar, sodyum hipoklorit dechorionated steril diyet aseptik transfer ve kapalı kaplarda yetiştirilir. Bakteri ile diyet ve embriyolar aşılamak gnotobiyotik dernekler yol açar ve bakteriyel varlığı tüm vücut Drosophila homojenatları kaplama ile teyit edilir.

Meyve Fly Yetiştirme<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Aksenik ve gnotobiyotik Koşullarında

Mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin analizi, mitokondriyal işlevselliğin düzenleyici mekanizmalarının tam olarak anlaşılması için gereklidir. Canlı ve sabit Drosophila yumurtalıklarında mitokondriyal yapı ve fonksiyonu incelemek için özel yöntemler bu yazıda açıklanmış ve gösterilmiştir.

Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi Drosophila Yumurtalıklar

Bu yöntem, patojen işgali üç boyutlu (3D) modelleri ile böcek hücreye görselleştirmek gösterilmiştir. Hemocytes Drosophila larvaları üzerinden viral veya bakteriyel patojenler, ex vivo veya vivo içindeile bulaşmış. Virüslü hemocytes daha sonra sabit ve görüntüleme için bir confocal mikroskop ve sonraki 3D hücresel yeniden yapılanma ile lekeli.

Hemocytes mikrobiyal enfeksiyon ve çözümleme çekme--dan Drosophila melanogaster larva

Bu iletişim kuralı, viral enfeksiyon vivo içinde virüs ana bilgisayar etkileşimi analiz için nano-enjeksiyon yöntemi ve temel teknikleri kullanarak Drosophila melanogaster içinde kurmak açıklar.

Viral enfeksiyon ve analiz Drosophila Melanogaster ana bilgisayar virüs etkileşimin kurulması

Drosophila hücre hatları temel ve Biyomedikal Araştırma önemli Kimyasalları vardır. Bu makalede çözdürme, subculturing ve araştırmacılar araştırma bu Kimyasalları kullanımı birleşmeyle yardımcı olmak için yaygın olarak kullanılan Drosophila hücre satırları dondurma protokolleri sağlar.

Çözdürme, kültür ve Drosophila hücre hatları Cryopreserving

Drosophila melanogaster yetişkin sinekleri, konakçı antimikrobiyal doğuştan gelen immün yanıtların ve mikrobiyal enfeksiyon stratejilerinin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için model organizmalar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. D. melanogaster larva aşamasını ek veya alternatif bir model sistem olarak tanıtmak için, bir larva enjeksiyon tekniği tanımlanmıştır.

Drosophila melanogaster Larva Enjeksiyon Protokolü

Burada, Drosophila yumurtalık nişindeki germ hattı kök hücrelerinin (GSC'ler) asimetrik bölünmesinin canlı görüntülemesini gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Spektrozom proteini Par-1'in yeşil floresan proteini (GFP) füzyonunu her yerde ifade eden bir transgenik çizgi kullanıyoruz.

Kadın Drosophila melanogaster Germline Kök Hücre Nişlerinin Genişletilmiş Canlı Görüntülenmesi

Öğrenin, Wolbachia ile enfekte Drosophila melanogaster JW18 hücre hattından monoklonal kültürler üretmeyi. Bu düşük maliyetli protokol, hücre stresini en aza indirerek tekrarlanabilir sonuçlar sağlar ve bakteri evrimini incelemede kullanılır.

Wolbachia ile enfekte Drosophila melanogaster JW18 Hücre Hattından Monoklonal Kültürlerin Üretilmesi

Daha fazla video keşfet