Name: Maya Yüzeyinde Görüntülenen Proteinlerin Enzimatik Modifikasyonu ve Akış Sitometrisi Değerlendirmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Keşfedin maya yüzeyinde enzimatik modifikasyon ve akış sitometrisi değerlendirmesi yöntemini. Bu protokol, enzim-substrat etkileşimlerinin kinetik haritalamasını basitleştirerek enzimoloji araştırmalarına yeni bir yaklaşım sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Plazmid barındıran mayanın hücre büyümesi ve protein ekspresyonunun indüksiyonu
<ol>
	<li>Tablo 1'de açıklanan tarifi takiben, plazmid içermeyen maya (YPD), plazmit içeren maya hücresi büyümesi (SD-CAA) ve protein ekspresyonunun indüksiyonu (SRG-CAA) ve ayrıca SD-CAA plakalarının büyümesi için gerekli ortamı hazırlayın.</li>
	<li>Kinaz-substrat çiftini içeren maya teşhir plazmid DNA'sını, çeşitli üreticilerin maya dönüşüm kitlerinde kullanım için yaygın olarak benimsenen lityum katyon bazlı yöntem30,31 aracılığıyla EBY-100 maya hücrelerine dönüştürün. NOT: Dönüştürülen plazmit yapısına bağlı olarak elektroporasyon32 veya diğer tercih edilen maya plazmit dönüşüm teknikleri kullanılabilir.</li>
	<li>10 mL YPD ortamı içeren 14 mL'lik bir kültür tüpü hazırlayın. EBY-100 hücrelerini aşılayın ve kültür 0.8-1.0 (8 x 106-1 x 107 hücre / mL) optik yoğunluğa (OD600nm) ulaşana kadar 30 ° C, 300 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde büyütün. NOT: OD600nm , ilgili ortamlarında 1:10 maya kültürü seyreltmesi içeren 3 mL numune küveti ve numune seyreltmeleri için kullanılan ortamı içeren 3 mL boş küvet hazırlanarak ölçülür. Spektrofotometre üzerindeki OD600nm programı, önce boş küveti, ardından her numune küvetini, her numune için hazırlanan ilgili seyreltmeyi ayarlayarak ölçmek için kullanılır. 1 OD600nm, 1 × 107 maya/mL'ye karşılık gelir.</li>
	<li>Kültürü 3 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyerek hücreleri hasat edin ve maya dönüşüm kitinde verilen 1. yıkama solüsyonu veya TE (10 mM Tris-HCl ve 1.0 mM EDTA) 31 ile yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri 3 dakika boyunca 1.000 x g'da tekrar pelet haline getirin ve maya dönüşüm kitinde veya steril suda sağlanan 1 mL dönüşüm tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreler 50 μL'lik alikotlara ayrılmalıdır ve -80 ° C'de 6 aya kadar saklanabilir.</li>
	<li>Plazmit transformasyonu için, plazmit başına bir alikot hazırlanır ve buz üzerinde çözülür, daha sonra maya görüntüleme yapısını içeren 0.5-1.5 μg plazmit DNA'sı doğrudan hücrelere eklenir. Maya dönüşüm kitinde sağlanan dönüşüm solüsyonunun 0,5 mL'si veya 0,5 mL steril P polietilen glikol ve 0,1 M LiOAc solüsyonu31 eklenir. Hücrelerin, plazmid DNA'nın ve transformasyon solüsyonunun karışımını pipetleyerek iyice birleştirin.</li>
	<li>Dönüşüm karışımını 30 ° C'de 30-60 dakika statik olarak inkübe edin, girdap karışımını 15 dakika aralıklarla inkübe edin. 1.000 × g'da 3 dakika santrifüjleyerek hücreleri hasat edin.</li>
	<li>4.5 mL SD-CAA ortamı ile 14 mL'lik bir kültür tüpü hazırlayın. İstenilen plazmidi içeren hücreleri 500 μL SD-CAA'da yeniden süspanse edin ve hazırlanan 4.5 mL'yi aşılayın.</li>
	<li>Agarı delmemeye dikkat ederek, 5 mL aşılanmış kültürün 50 μL'sini bir SD-CAA plakasına dağıtın ve dönüşüm verimliliğini belirlemek için 30 °C'de 48 saat statik olarak inkübe edin.</li>
	<li>5 mL SD-CAA hücre kültürünü 30 ° C, 300 rpm'de en az 18 saat boyunca çalkalayan bir inkübatörde inkübe edin. Optik yoğunluğu (OD600nm) 16 saat ve 20 saat sonra izleyin. Numune 6'yı aşmayan yeterli bir optik yoğunluğa ulaştığında, kültürü 2.500 × g'da 3 dakika santrifüjleyin. Maya peletini bozmadan süpernatanı atın.</li>
	<li>SRG-CAA'daki maya peletini 1'den daha düşük (107 maya / mL'× &lt;1 son OD600nm'ye yeniden süspanse edin).</li>
	<li>Maya kültürünü 30 ° C, 300 rpm'de çalkalanan bir inkübatörde en az 8 saat, ancak 24 saatten daha uzun olmamak üzere inkübe edin. NOT: Maya hücrelerinde protein ekspresyonunun indüksiyonu 20-37 °C arasında herhangi bir yerde değiştirilebilir. 30 °C, kinaz/substrat çiftlerinin sentezi için uygundur29,33, ancak incelenen spesifik proteinler için gerekli görüldüğü takdirde ayarlanabilir.</li>
	<li>Hücre yoğunluğunu belirlemek için OD600nm'yi ölçün. NOT: Protokol bu noktada maya kültürlerini 4 °C'de saklayarak durdurulabilir.</li>
</ol>
2. 4G10 anti-fosfotirozin antikorunun biyotinilasyonu
<ol>
	<li>2 mg'lık bir PEG4-NHS-Biotin şişesini, 680 μL steril PBS ekleyerek 5 mM'lik bir nihai konsantrasyona yeniden süspanse edin. NOT: PEG4-NHS-Biotin'in yeniden süspansiyonu, biyotinilasyon reaksiyonu gerçekleştirilmeden hemen önce taze olarak yapılmalıdır. NHS sulu çözelti içinde hidrolize olur. Steril PBS ve şişelerin kullanımı, uzun süreli depolama için reaktiflerin hazırlanması ve kirleticilerin reaktif canlılığı veya gerçekleştirilen hassas tahliller üzerindeki olası etkilerini azaltmak için hücre bazlı tahlillerde kullanım için önemlidir.</li>
	<li>4G10 antikor konsantrasyonuna dayanarak, steril 1.7 mL'lik bir şişeye 100 μg antikor ekleyin.</li>
	<li>7.5: 1'lik bir molar biyotin / antikor oranı elde etmek için 100 μg 4G10 antikorunu tutan şişeye adım 2.1'den hazırlanan 5 mM PEG4-NHS-Biotin'den 1 μL ekleyin. Reaksiyonu homojen hale getirmek için karışımı nazikçe pipetleyin.</li>
	<li>Reaksiyonu oda sıcaklığında en az 2 saat sabit dönüşle inkübe edin.</li>
	<li>Tamponu biyotinile edilmiş 4G10'dan (B-4G10) PBS'ye değiştirmek için 0,5 mL spin tuzdan arındırma kolonları için üreticinin protokolünü izleyin. NOT: 7 kDa'lık bir moleküler ağırlık kesme (MWCO) ile tuzdan arındırma kolonları, daha büyük antikoru korurken reaksiyona girmemiş biyotin ve diğer küçük moleküllerin uzaklaştırılmasına izin vermek için antikorların biyotinilasyonu için yaygın olarak kullanılır.</li>
	<li>B-4G10 antikorunu PBSA'da (1 g / L sığır serum albümini ile PBS) 1 μM'lik bir nihai konsantrasyona seyreltin. Tekrarlanan donma/çözülme döngülerini önlemek için B-4G10 antikorunu daha küçük hacimlere ayırın. NOT: Biyotinillenmiş antikorlar, önemli bir verimlilik kaybı olmadan 3 aya kadar günlük kullanım için 4 ° C'de saklanabilir. Kullanılmayan alikotların geri kalanını -20 °C'de en fazla 2 yıl saklayın.</li>
</ol>
3. Maya hücresi yüzeyinde eksprese edilen substratların defosforilasyonu
<ol>
	<li>2x çalışma tamponu çözeltisini daha önce literatürdeaçıklandığı gibi hazırlayın 34. NOT: İhtiyaç duyulan bileşenlerin ölçümünü kolaylaştırmak için 2x önerilir.</li>
	<li>Adım 3.1 1:2'de hazırlanan 2x tampon çözeltisini deiyonize suda seyrelterek 1.7 mL'lik bir şişedeki numuneler için çalışma tamponunu hazırlayın. NOT: Her numune için toplam reaksiyon hacmi 20 μL olacaktır ve her numune 10 μL ile 18 μL arasında herhangi bir çalışma tamponu gerektirecektir. Tüm numuneler veya kontroller için yeterli çalışma tamponu hazırlayın.</li>
	<li>Tablo 2'de açıklanan önerilen numune hazırlamanın ardından, 1.7 mL'lik şişeleri ilgili kontrol veya numune adıyla etiketleyin.</li>
	<li>Adım 1.9'da ölçülen OD600nm'ye dayanarak, her numune için karşılık gelen maya kültüründen iki milyon (2 × 106) maya hücresini geri kazanmak için gerekli kültür hacmini hesaplayın.</li>
	<li>Önceki adımda hesaplanan maya kültürü hacmini her numune için 1,7 mL'lik şişeye ekleyin.</li>
	<li>Şişeyi 4.500 × g'da 1 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir mikropipet kullanarak dikkatlice çıkarın ve biyolojik olarak tehlikeli atık olarak atın.</li>
	<li>Peletlenmiş hücreleri 1 mL PBSA içinde yeniden süspanse edin ve adım 3.6'yı tekrarlayın. NOT: Peletlenmiş hücreleri rahatsız etmeden mümkün olduğunca fazla süpernatanın çıkarılması önemlidir.</li>
	<li>Stok konsantrasyonuna bağlı olarak, 20 μL'lik bir toplam reaksiyon hacminde 1.000 nM'lik bir nihai konsantrasyona sahip olması gereken rekombinant insan SHP-2 hacmini hesaplayın. NOT: Rekombinant SHP-2, her tahlilde kullanılan herhangi bir proteinin ikiden fazla donma-çözülme döngüsünden geçmemesi için küçük hacimlerde aliquote edilmelidir. Tüm numuneler bir tahlil için hazırlandıktan sonra bir alikottan kalan herhangi bir SHP-2 atılmalıdır. Rekombinant enzimlerin stok konsantrasyonları lot numarasına bağlı olarak değişebilir. Rekombinant SHP-2 yaygın olarak 0.2-0.4 mg / mL'lik bir stok konsantrasyonunda formüle edilir. 0.324 mg / mL SHP-2'lik bir stok konsantrasyonu için bu, 4.696 μM'lik bir stok konsantrasyonuna karşılık gelir (SHP-2'nin moleküler ağırlığı 69 kDa'dır). 20 μL'lik bir reaksiyonda 4.26 μL'lik SHP-2 stoğu, 1.000 nM SHP-2'lik bir nihai reaksiyon konsantrasyonu ile sonuçlanır.</li>
	<li>5 mM'lik bir DTT çözeltisi oluşturmak için 15 mL'lik bir konik içinde hazırlanan 10 mL deiyonize suya 7.7 mg DTT ekleyin. Ekipman sınırlamaları miligram tartmayı zorlaştırıyorsa, 10 mL deiyonize suya 0,77 g DTT ekleyin, ardından tahlil için kullanılan 5 mM DTT çözeltisini oluşturmak için 100x seyreltme gerçekleştirin. NOT: DTT çözeltisi, mevcut ekipman kullanılarak miligram ölçekli miktarların ölçülmesi mümkün değilse, 5 mM'ye seyreltilmek üzere daha yüksek konsantrasyonlu stok çözeltilerinde hazırlanabilir. DTT çözeltisinin, hidrolize olma eğilimi nedeniyle çalışma tamponunda taze önceki hücre yeniden süspansiyonu hazırlanması gerekir, bu da su içinde seyreltildiğinde uzun süreler boyunca kararsız hale gelir.</li>
	<li>Peletlenmiş hücreleri, her numune veya kontroldeki nihai reaksiyon hacmi 20 μL olacak şekilde adım 3.2'de hazırlanan çalışma tamponunda yeniden süspanse edin. NOT: Eklenen çalışma tamponu miktarı, her numunede bulunacak olan DTT (2 μL) ve SHP-2 (adım 3.8'de hesaplanan) miktarına göre hesaplanmalıdır.</li>
	<li>Her numuneye adım 3.9'da hazırlanan 5 mM DTT çözeltisinden 2 μL ekleyin veya 0.5 mM DTT'lik bir son reaksiyon konsantrasyonunu kontrol edin.</li>
	<li>Adım 3.8'de hesaplanan SHP-2 hacmini, 20 μL'lik bir son hacim için her numuneye ekleyin ve bir mikropipet kullanarak hafifçe karıştırın.</li>
	<li>Sızıntıyı veya çapraz kontaminasyonu önlemek için numune şişesi kapaklarını parafilm ile sarın.</li>
	<li>Numuneleri 37 °C'de 2 saat boyunca bir rotor üzerinde sabit bir hızda inkübe edin.</li>
	<li>Numuneleri rotordan çıkarın ve her numuneye 1 mL PBSA ekleyerek reaksiyonu durdurun.</li>
	<li>Adım 3.6'yı tekrarlayın.</li>
</ol>
4. Defosforile substratların hücre etiketleme ve akış sitometrisi analizi
<ol>
	<li>Numune 3.16. adımdan numuneleri, Tablo 2'de açıklandığı gibi karşılık gelen birincil reaktiflerinin 20 μL'lik bir karışımında yeniden süspanse edin. Numuneleri oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. NOT: Kullanılan tüm reaktif konsantrasyonlarının, maya hücrelerinin yüzeyinde eksprese edilen protein sayısına göre fazla olduğu hesaplanmıştır. Hesaplama, rutin olarak sadece ~P'si bunu yaptığında, bir numune35'teki 2 x 106 mayanın tümünden 10.000 protein/hücrenin ekspresyonunu varsayar. Tablo 3, Tablo 2'de ifade edilen reaktiflerin her biri için aşağıdaki gibi hesaplanan fazla etiketleme reaktif oranını göstermektedir: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq1v3.jpg" style="margin: auto;"></li>
	<li>Numuneleri 1 dakika boyunca 4.500 × g'da santrifüjleyin ve süpernatanı biyolojik olarak tehlikeli atık olarak atın.</li>
	<li>1 mL PBSA'da yeniden süspanse ederek hücreleri bir kez yıkayın. Adım 4.2'yi tekrarlayın.</li>
	<li>Numuneleri, Tablo 20'de açıklandığı gibi karşılık gelen ikincil reaktiflerinin 2 μL'lik bir karışımında yeniden süspanse edin. Numuneleri ışık yokluğunda 15 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Adım 4.2'yi tekrarlayın.</li>
	<li>Adım 4.3'ü tekrarlayın.</li>
	<li>Yıkanmış numuneleri 300-500 μL PBSA içinde yeniden süspanse edin ve uygun bir akış sitometresi kullanarak hemen analiz etmek için 5 mL polistiren tüplere aktarın. NOT: Numunelerin taşınması gerekiyorsa, ıslak buz üzerinde tutun. Tavsiye edilmez, ancak numuneler 4 °C'de ıslak peletler halinde en fazla 2 saat saklanabilir.</li>
	<li>Yeni bir deney için sitometrenin gerekli başlatılmasını ve hazırlanmasını gerçekleştirdikten sonra, Dosya menüsündeki Yeni Deney düğmesine tıklayın, deneyi adlandırın ve elde edilen verilerin istenen dosya yoluna kaydedildiğinden emin olmak için Kaydet'e tıklayın.</li>
	<li>Çalıştırılacak her örnek için iki veya daha fazla nokta çizimi oluşturmak için üst araç çubuğundaki nokta grafiği simgesini seçin. Nokta grafiklerinden biri için, FSC-A kanalını görüntülemek için X ekseni adını ve SSC-A kanalını görüntülemek için Y ekseni adını seçin. Bu çizim, Yan Saçılma - Alana karşı İleri Dağılım - Alanını gösterir ve daha fazla analiz için maya hücrelerini geçit etmek için kullanılır.</li>
	<li>Başka bir nokta grafiğinde, birincil anti-epitop etiketi antikorunu hedefleyen ikincil reaktifin floresan olduğu kanalı görüntülemek için X ekseni adını seçin. Streptavidin ikincil reaktifinin floresan yayıldığı kanalı görüntülemek için Y ekseni adını seçin. Bu çizim, maya hücreleri olarak yalnızca yandan ve ileri saçılma grafiğinden geçitli olayları gösterecektir ve Y ekseninde tirozin fosforilasyonunu ve X ekseninde substrat yüzey ifadesini görüntülemek için kullanılır. NOT: Birincil anti-epitop etiketi antikorunu hedefleyen ikincil reaktif, bu örnekte FITC (AF-488) kanalında floresan ve streptavidin ikincil reaktifi AF-647 kanalında floresan olur. Kullanılan kanallar, etiketleme sırasında kullanılan birincil ve ikincil reaktiflere bağlı olarak değişebilir.</li>
	<li>Her bir numune tüpünü sitometrenin tüp tutucusuna yerleştirin ve sitometrenin numuneyi yüklemeye ve veri almaya başlaması için Çalıştır'ı seçin. Görüntülenecek olayları, kaydedilecek olayları, kaydedilecek zamanı ve örnek akış hızını gerektiği gibi ayarlayın.</li>
	<li>Adım 4.9'da oluşturulan SSC-A ve FSC-A grafiğinde sağlıklı maya hücrelerini çevreleyen bir kapı tanımlayın. Şekil 1 , uygulanacak geçit stratejisinin açıklayıcı bir temsilini göstermektedir. NOT: SSC-A ve FSC-A grafiğinde, görüntülenecek 100.000 olay ve tanımlanan maya kapısı içinde kaydedilecek 50.000 olay, daha fazla analiz için yeterli veriyi görselleştirmek ve toplamak için iyi bir kılavuzdur. Tekil maya için seçilecek daha katı geçit stratejileri, yakın zamanda bildirildiği gibi İleri Saçılma Yüksekliği ve İleri Saçılma Alanı grafiğine dayalı olarak uygulanabilir36. Şekil 1'de gösterilen geçit stratejisi, saçılma kapısı yoluyla singlet ve bir miktar çift maya dahil olmak üzere daha az katı bir yaklaşıma karşılık gelir.</li>
	<li>Bir akış sitometrisi analizörü kullanarak tüm kontrol numunelerinin floresansını kaydedin. Aşağıda adım 4.14'te açıklandığı gibi, bir geçit stratejisinin tanımlanmasına yardımcı olmak için önce kontrol örnekleri rutin olarak toplanır.</li>
	<li>İşlem görmüş numuneleri analiz etmeden önce adım 4.10'da oluşturulan grafiğiniz için bir geçit stratejisi tanımlayın. Şekil 1 , uygulanacak geçit stratejisinin açıklayıcı bir temsilini göstermektedir.</li>
	<li>Akış sitometresini ve adım 4.12 ve 4.14'te tanımlanan geçit stratejisini kullanarak fosforile edilmiş numunelerin floresansını kaydedin.</li>
	<li>Bir akış sitometrisi analiz yazılımı kullanılarak elde edilen akış sitometrisi verilerini analiz edin.</li>
	<li>Yüzeylerinde protein eksprese eden hücrelerin Y ekseni medyanını ve numuneler ve kontroller arasında görüntülenmeyen hücreler tarafından sağlanan temel fosforilasyonu ölçerek ve karşılaştırarak defosforilasyonu değerlendirin. Medyan fosforilasyon yüzdesi farkını aşağıdaki gibi hesaplayın: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68208/68208eq2v5.jpg" style="margin: auto;"></li>
</ol>

<ol><li>Lea, M. A., Weber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+enzymes+in+homeostasis%3A+VIII.+Inhibition+of+the+activity+of+glycolytic+enzymes+by+free+fatty+acids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Role of enzymes in homeostasis: VIII. Inhibition of the activity of glycolytic enzymes by free fatty acids.</a> J Biol Chem. 243 (6), 1096-1102 (1968).</li>
<li>Mahé, M., Rios-Fuller, T. J., Karolin, A., Schneider, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+enzymatic+dysfunctions+in+metabolic+disorders+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genetics of enzymatic dysfunctions in metabolic disorders and cancer.</a> Front Oncol. 13, 1230934(2023).</li>
<li>Fernandez-de-Cossio-Diaz, J., Vazquez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+physical+model+of+cell+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A physical model of cell metabolism.</a> Sci Rep. 8 (1), 8349(2018).</li>
<li>Metallo, C. M., Vander Heiden, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+metabolic+regulation+and+its+influence+on+cell+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Understanding metabolic regulation and its influence on cell physiology.</a> Mol Cell. 49 (3), 388-398 (2013).</li>
<li>Mildvan, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+signaling+and+related+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteins%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of signaling and related enzymes.</a> Proteins. 29 (4), 401-416 (1997).</li>
<li>Frosina, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+enzymes+that+repair+endogenous+damage+to+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Overexpression of enzymes that repair endogenous damage to DNA.</a> Eur J Biochem. 267 (8), 2135-2149 (2000).</li>
<li>Schärer, O. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+biology+of+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Chemistry and biology of DNA repair.</a> Angew Chem Int Ed. 42 (26), 2946-2974 (2003).</li>
<li>de la Fuente, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+therapy%3A+Current+challenges+and+future+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Enzyme therapy: Current challenges and future perspectives.</a> Int J Mol Sci. 22 (17), 9181(2021).</li>
<li>Robertson, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymes+as+a+special+class+of+therapeutic+target%3A+clinical+drugs+and+modes+of+action%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Enzymes as a special class of therapeutic target: clinical drugs and modes of action.</a> Curr Opin Struct Biol. 17 (6), 674-679 (2007).</li>
<li>Goddard, J. -P., Reymond, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+assays+for+high-throughput+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Enzyme assays for high-throughput screening.</a> Curr Opin Biotechnol. 15 (4), 314-322 (2004).</li>
<li>Helm, J. S., Hu, Y., Chen, L., Gross, B., Walker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+active-site+inhibitors+of+MurG+using+a+generalizable%2C+high-throughput+glycosyltransferase+screen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Identification of active-site inhibitors of MurG using a generalizable, high-throughput glycosyltransferase screen.</a> J Am Chem Soc. 125 (37), 11168-11169 (2003).</li>
<li>Veldhuyzen, W. F., Nguyen, Q., McMaster, G., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light-activated+probe+of+intracellular+protein+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">A light-activated probe of intracellular protein kinase activity.</a> J Am Chem Soc. 125 (44), 13358-13359 (2003).</li>
<li>Torres, M., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTorres%2C+M+%22Encyclopedia+of+Respiratory%22">Encyclopedia of Respiratory</a>. Laurent, G. J., Shapiro, S. D. , Academic Press. 10-18 (2006).</li>
<li>Blume-Jensen, P., Hunter, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+kinase+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogenic kinase signalling.</a> Nature. 411 (6835), 355-365 (2001).</li>
<li>Martin, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling and cancer.</a> Cancer Cell. 4 (3), 167-174 (2003).</li>
<li>Lothrop, A. P., Torres, M. P., Fuchs, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+post-translational+modification+codes%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Deciphering post-translational modification codes.</a> FEBS Lett. 587 (8), 1247-1257 (2013).</li>
<li>Graves, J. D., Krebs, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphorylation+and+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Protein phosphorylation and signal transduction.</a> Pharmacol Ther. 82 (2), 111-121 (1999).</li>
<li>Hafen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinases+and+phosphatases--A+marriage+is+consummated%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Kinases and phosphatases--A marriage is consummated.</a> Science. 280 (5367), 1212-1213 (1998).</li>
<li>Westphal, R. S., Anderson, K. A., Means, A. R., Wadzinski, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signaling+complex+of+Ca2%2B-calmodulin-dependent+protein+kinase+IV+and+protein+phosphatase+2A%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A signaling complex of Ca2+-calmodulin-dependent protein kinase IV and protein phosphatase 2A.</a> Science. 280 (5367), 1258-1261 (1998).</li>
<li>Barford, D., Das, A. K., Egloff, M. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+and+mechanism+of+protein+phosphatases%3A+Insights+into+catalysis+and+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys+Biomol+Struct%22%5BJournal%5D)">The structure and mechanism of protein phosphatases: Insights into catalysis and regulation.</a> Annu Rev Biophys Biomol Struct. 27, 133-164 (1998).</li>
<li>Liu, Q., Qu, J., Zhao, M., Xu, Q., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+SHP2+as+a+promising+strategy+for+cancer+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting SHP2 as a promising strategy for cancer immunotherapy.</a> Pharmacol Res. 152, 104595(2020).</li>
<li>Pan, J., Zhou, L., Zhang, C., Xu, Q., Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+phosphatases+for+the+treatment+of+inflammation-related+diseases%3A+From+signaling+to+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Targeted+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting protein phosphatases for the treatment of inflammation-related diseases: From signaling to therapy.</a> Signal Transduct Targeted Ther. 7 (1), 177(2022).</li>
<li>Denard, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((YESS+2.0%2C+a+tunable+platform+for+enzyme+evolution%2C+yields+highly+active+TEV+protease+variants%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">YESS 2.0, a tunable platform for enzyme evolution, yields highly active TEV protease variants.</a> ACS Synth Biol. 10 (1), 63-71 (2021).</li>
<li>Lim, S., Glasgow, J. E., Filsinger Interrante, M., Storm, E. M., Cochran, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+display+of+proteins+on+the+yeast+cell+surface+simplifies+quantification+of+binding+interactions+and+enzymatic+bioconjugation+reactions%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+J%22%5BJournal%5D)">Dual display of proteins on the yeast cell surface simplifies quantification of binding interactions and enzymatic bioconjugation reactions.</a> Biotechnol J. 12 (5), (2017).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+of+TEV+protease+variants+by+yeast+ER+sequestration+screening+%28YESS%29+of+combinatorial+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Engineering of TEV protease variants by yeast ER sequestration screening (YESS) of combinatorial libraries.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110 (18), 7229-7234 (2013).</li>
<li>Yi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+endoplasmic+reticulum+sequestration+screening+for+the+engineering+of+proteases+from+libraries+expressed+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Yeast endoplasmic reticulum sequestration screening for the engineering of proteases from libraries expressed in yeast.</a> Methods Mol Biol. 1319, 81-93 (2015).</li>
<li>Semenza, J. C., Hardwick, K. G., Dean, N., Pelham, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERD2%2C+a+yeast+gene+required+for+the+receptor-mediated+retrieval+of+luminal+ER+proteins+from+the+secretory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ERD2, a yeast gene required for the receptor-mediated retrieval of luminal ER proteins from the secretory pathway.</a> Cell. 61 (7), 1349-1357 (1990).</li>
<li>Mei, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+aromatic+residue-controlled+protein+retention+in+the+endoplasmic+reticulum+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of aromatic residue-controlled protein retention in the endoplasmic reticulum of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 292 (50), 20707-20719 (2017).</li>
<li>Ezagui, J., Russell, B., Mairena, Y., Stern, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum+sequestration+empowers+phosphorylation+profiling+on+the+yeast+surface%5BTitle%5D)+AND+%22AIChE+J%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum sequestration empowers phosphorylation profiling on the yeast surface.</a> AIChE J. 68 (12), e17931(2022).</li>
<li>Kawai, S., Murata, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKawai%2C+S+%22Genetic+Transformation+Systems+in+Fungi%22">Genetic Transformation Systems in Fungi</a>. van den Berg, M. A., Maruthachalam, K. 1, Springer International Publishing. 187-192 (2015).</li>
<li>Kawai, S., Hashimoto, W., Murata, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+other+fungi%3A+methods+and+possible+underlying+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">Transformation of Saccharomyces cerevisiae and other fungi: methods and possible underlying mechanism.</a> Bioeng Bugs. 1 (6), 395-403 (2010).</li>
<li>Loock, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+and+expression+of+genomic+libraries+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation and expression of genomic libraries in yeast.</a> Methods Protoc. 6 (5), 89(2023).</li>
<li>Huang, D., Gore, P. R., Shusta, E. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+yeast+secretion+of+heterologous+proteins+by+regulating+expression+rates+and+post-secretory+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Increasing yeast secretion of heterologous proteins by regulating expression rates and post-secretory loss.</a> Biotechnol Bioeng. 101 (6), 1264-1275 (2008).</li>
<li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+protein+tyrosine+phosphatase+SHP2+for+the+treatment+of+PTPN11-associated+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting protein tyrosine phosphatase SHP2 for the treatment of PTPN11-associated malignancies.</a> Mol Cancer Ther. 12 (9), 1738-1748 (2013).</li>
<li>Stern, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+and+expression+enhance+enrichment+of+functional+yeast-displayed+ligands+via+cell+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Geometry and expression enhance enrichment of functional yeast-displayed ligands via cell panning.</a> Biotechnol Bioeng. 113 (11), 2328-2341 (2016).</li>
<li>Pan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+single-cell+gates+for+yeast+display+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng+Design+Sel%22%5BJournal%5D)">Optimized single-cell gates for yeast display screening.</a> Protein Eng Design Sel. 38, gzae018(2025).</li>
<li>Margittai, É, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+H2O2+in+the+endoplasmic+reticulum+promotes+in+vivo+disulfide+bond+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">Production of H2O2 in the endoplasmic reticulum promotes in vivo disulfide bond formation.</a> Antioxid Redox Signal. 16 (10), 1088-1099 (2012).</li>
<li>Werner-Washburne, M., Braun, E., Johnston, G. C., Singer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stationary+phase+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Stationary phase in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiol Rev. 57 (2), 383-401 (1993).</li>
<li>Ezagui, J., Stern, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tyrosine+phosphorylation+screening+on+the+yeast+surface+by+magnetic+bead+selection+and+FACS%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tyrosine phosphorylation screening on the yeast surface by magnetic bead selection and FACS.</a> Methods Mol Biol. 2681, 275-290 (2023).</li>
<li>Yarnall, M. T. N., Kim, S. H., Korntner, S., Bishop, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+the+SHP2+and+SHP1+protein+tyrosine+phosphatase+domains+by+a+non-conserved+%E2%80%9Cbackdoor%E2%80%9D+cysteine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Rep%22%5BJournal%5D)">Destabilization of the SHP2 and SHP1 protein tyrosine phosphatase domains by a non-conserved “backdoor” cysteine.</a> Biochem Biophys Rep. 32, 101370(2022).</li>
<li>Dustin, C. M., Heppner, D. E., Lin, M. J., van der Vliet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Redox+regulation+of+tyrosine+kinase+signalling%3A+more+than+meets+the+eye%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Redox regulation of tyrosine kinase signalling: more than meets the eye.</a> J Biochem. 167 (2), 151-163 (2020).</li>
<li>Stern, L. A., Csizmar, C. M., Woldring, D. R., Wagner, C. R., Hackel, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Titratable+avidity+reduction+enhances+affinity+discrimination+in+mammalian+cellular+selections+of+yeast-displayed+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Comb+Sci%22%5BJournal%5D)">Titratable avidity reduction enhances affinity discrimination in mammalian cellular selections of yeast-displayed ligands.</a> ACS Comb Sci. 19 (5), 315-323 (2017).</li>
<li>Waldman, A. C., Rao, B. M., Keung, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+the+residue+specificities+of+epigenome+enzymes+by+yeast+surface+display%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Mapping the residue specificities of epigenome enzymes by yeast surface display.</a> Cell Chem Biol. 28 (12), 1772-1779.e4 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 L Medya Şişeleri&nbsp;</td><td>Corning</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>1.7 / 2.0 mL Mikrotüpler</td><td>Axygen</td><td>MCT-175-C</td><td></td></tr><tr><td>10 & mikro; L SureOne Pipet Uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-438</td><td></td></tr><tr><td>1000 & mikro; L SureOne Pipet Uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-408</td><td></td></tr><tr><td>12 mL Polistiren Yuvarlak Tabanlı Tüpler</td><td>Greiner</td><td>07-000-212</td><td></td></tr><tr><td>3 mL platik Küvetler</td><td>MARKA</td><td>759076D</td><td></td></tr><tr><td>300 & L SureOne Pipet Uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-411</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Serolojik Pipetler</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Asit Kazein (Kasamino Asitler)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP-1424-500</td><td></td></tr><tr><td>Analitik Terazi&nbsp;</td><td>Mettler Toledo</td><td>30243397</td><td></td></tr><tr><td>Bakteriyolojik Petri Kabı&nbsp;</td><td>Corning</td><td>Falcon 351008</td><td></td></tr><tr><td>Biyogüvenlik Kabinleri</td><td>Labconco</td><td>Mantık Sınıf II, Tip A2&nbsp; 302310102</td><td></td></tr><tr><td>Biyospektrometre</td><td>Eppendorf</td><td>Kinetik 6136000010</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin Fisher</td><td>biyoreaktifleri</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Sitrik Asit</td><td>Fisher Scientific</td><td>A940-500</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX Akış Sitometrisi Analizör&nbsp;</td><td>Beckam Coulter</td><td>Cytoflex C09745</td><td>CytExpert yazılımı</td></tr><tr><td>Dekstroz</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Fisher biyoreaktifleri</td><td>BP172-5</td><td></td></tr><tr><td>Eşek anti-keçi FITC</td><td>Invitrogen</td><td>A16000</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Alfa Aesar</td><td>H56165.30</td><td></td></tr><tr><td>Ez-Link PEG4-NHS-Biotin</td><td>Thermo Scientific</td><td>A39259</td><td></td></tr><tr><td>Frozen-EZ Maya Transformasyonu II Kiti&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>T2001</td><td></td></tr><tr><td>Galaktoz</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP656-500</td><td></td></tr><tr><td>Genel Amaçlı Buzdolabı</td><td>Marvel Scientific</td><td>MS24RAS4RW</td><td></td></tr><tr><td>Keçi anti-myc etiket antikoru&nbsp;</td><td>Bethyl</td><td>A190-104A</td><td></td></tr><tr><td>Miktrotüp Santrifüj&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5425 R 5406000313</td><td></td></tr><tr><td>Mini Düşük Sıcaklık Soğutmalı İnkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-015-2632</td><td></td></tr><tr><td>Fare anti-fosfotirozin antikoru 4G10</td><td>BioXcell</td><td>BE0194</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>Bemis</td><td>M PM999</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin&nbsp;</td><td>Fisher bioreagents</td><td>BP399-500</td><td></td></tr><tr><td>Pipet Kontrol Cihazı&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>easypet 3 4430000018</td><td></td></tr><tr><td>Rafinoz</td><td>Thermo Scientific</td><td>J21060-36</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinant insan Aktif SHP-2 Protein</td><td>R& D Systems</td><td>1894-SH</td><td></td></tr><tr><td>Soğutmalı Santrifüj&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae maya yüzey teşhir suşu EBY 100</td><td>ATCC</td><td>MYA-4941</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı İnkübatör</td><td>Eppendorf</td><td>M1335-0002 New Brunswick Innova 42&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tek Kanallı Pipet Seti&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>05-403-151</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Klorür</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Sitrat Dihidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Dibazik Heptahidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S373-500</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum Fosfat Monobazik Monohidrat</td><td>Fisher Scientific</td><td>S468-500</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Alexa Fluor 647</td><td>Invitrogen</td><td>S32357</td><td></td></tr><tr><td>Üstten Yükleme Dengesi</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris hidroklorür</td><td>EMD Millipore</td><td>648317-100GM</td><td></td></tr><tr><td>Tüp tabanca döndürücü</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-676-341</td><td></td></tr><tr><td>Tartı Kağıdı&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-898-12B</td><td></td></tr><tr><td>Maya Azot Bazlı</td><td>BD Difco</td><td>291940</td><td></td></tr><tr><td>Zeba Spin Tuz Giderme Kolonları&nbsp;</td><td>Termo Bilimsel</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

maya yüzeyinde görüntülenen proteinlerin enzimatik modifikasyonu ve akış sitometrisi değerlendirmesi

Enzymatic Modification and Flow Cytometry Assessment of Yeast Surface Displayed Proteins

(Şekil 1A) ve (Şekil 1B) 1.000 nM SHP-2 olmadan 2 saat inkübe edilen model sistemimizin bireysel bir kopyasından alınan akış sitometrisi analizi, c.6'lık bir medyan fosforilasyon farkı ortaya çıkarır, bu da Y ekseni medyanının oranı olarak tanımlanır (fosforilasyon) tüm yüzey görüntülenen olaylardan eksi denklemde açıklandığı gibi muamele edilen numune ile tedavi edilmeyen kontrol arasındaki görüntülenmeyen olayların Y ekseni medyanı olarak tanımlanan temel fosf...

Maya Yüzeyinde Görüntülenen Proteinlerin Enzimatik Modifikasyonu ve Akış Sitometrisi Değerlendirmesi

Yeast surface display is a genotype-phenotype linkage strategy that empowers high-throughput screening of protein function. Traditionally, yeast surface ...

enzymatic-modification-flow-cytometry-assessment-yeast-surface

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Bozulma ve geri dönüşüm için maya vakuol asidik lümen organelleri teslim izlemek için sağlam bir yaklaşım açıklanmıştır. Bu yöntem, genetik olarak kodlanmış çift emisyon floresan pH biyosensör ve floresan mikroskobu kullanarak tek tek hücrelerin görselleştirme hedef organellerin özel etiketleme dayanmaktadır.

Maya İzleme Mitophagy Floresan Mikroskopi Testi Saccharomyces cerevisiae

Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Akış sitometrisi ve mikroskopiye dayanan iki yardımcı yöntem mayada bir MAPK yolağının aktivasyonu ile uyarılan gen ekspresyonunun dinamiklerinin tek hücre düzeyinde miktarının, ki olanak sunulmaktadır.

Tek Maya Hücreleri MAPK İsteyerek İfade zamansal Kantitasyonu

Bu makale, protein bozunması için genetik gereksinimlerin belirlenmesi için maya büyümesine dayalı bir testi açıklamaktadır. Ayrıca, bozunma gereksinimlerini biyokimyasal olarak doğrulamak için batı lekelemeye uygun maya proteinlerinin hızlı bir şekilde ekstraksiyonu için bir yöntem gösterir. Bu teknikler, çeşitli proteinlerin bozunmasını izlemek için uyarlanabilir.

Büyüme-tabanlı Belirlenmesi ve Protein Parçalanabilirliklerinin Genetik Talepler biyokimyasal Onay<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Veziküler kaçakçılık olaylarının doğru bir şekilde ölçülmesi, genellikle belirli proteinlerin rolleri ve mutasyonların etkileri hakkında önemli bilgiler sağlar. Bu makale, kantitatif floresan mikroskobu ve akış sitometrisi kullanılarak canlı hücrelerde endositik olayların nicelleştirilmesi için bir araç olarak pH'a duyarlı bir GFP varyantı olan süperekliptik pHluorin'i kullanma yöntemlerini sunmaktadır.

Budding Maya endositozun kantitatif, kinetik ve Yüksek verim Analizi pHluorin Uygulamaları

Protein toplama hücresel oksidatif stres ortaya çıkarır. Bu iletişim kuralı amyloidogenic proteinlerin hücre içi Birleşik ve onlarla akış sitometresi kullanarak ilişkili oksidatif stres izlemek için bir yöntem açıklanır. Yaklaşım β-amiloid peptid çözünür ve toplama eğilimli türevleri davranışını incelemek için kullanılır.

Protein toplama Maya hücresel oksidatif stres üzerinde etkisi değerlendirilmesi

Bu makalede, her iki S. cerevisiae ve HEK293T hücrelerinde protein kendinden montajı ölçmek için fret tabanlı akış sitometri Protokolü açıklanır.

Algılama ve ölçme protein Self-montaj In vivo tarafından akış sitometri

Bu protokol, ilgilenilen bir antijene bağlanan protein varyantlarını zenginleştirmek için maya yüzeyi teşhir seçimi kampanyalarının yürütülmesi için temel adımları açıklar.

Maya Yüzey Ekranı ile Protein Mühendisliği

Burada, maya örneklerinde stres sonrası sağkalımı ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Test, plazma zarı bütünlüğünü ölçmek için SYTO 9 ve propidyum iyodür (PI) olmak üzere iki floresan boya kullanır. Oksidatif stres sonrası numuneler için canlı, ölü ve hasarlı hücre fraksiyonlarının kantitatif ve tekrarlanabilir tahminlerini sağlamak için akış sitometrisi kullanır.

Maya Hücrelerinde Stres Sonrası Sağkalımı Ölçmek için Akış Sitometrisi ile Birleştirilmiş Optimize Edilmiş Bir CANLI / ÖLÜ Testi

Bu yazıda, RAW 264.7 hücreleri tarafından polianhidrid nanopartiküller veya bakteri içselleştirilmesi ölçmek için multi-spektral görüntüleme sitometrisi kullanan bir metodu tanımlar.

Çoklu-spektral Görüntüleme Akım Sitometri tarafından Nanopartiküller ve Bakterilerin Hücresel İçselleştirilmesi Analizi

Keşfedin maya yüzeyinde enzimatik modifikasyon ve akış sitometrisi değerlendirmesi yöntemini. Bu protokol, enzim-substrat etkileşimlerinin kinetik haritalamasını basitleştirerek enzimoloji araştırmalarına yeni bir yaklaşım sunar.

Maya Yüzeyinde Görüntülenen Proteinlerin Enzimatik Modifikasyonu ve Akış Sitometrisi Değerlendirmesi

Daha fazla video keşfet