Maya Yüzeyinde Görüntülenen Proteinlerin Enzimatik Modifikasyonu ve Akış Sitometrisi Değerlendirmesi

Bu araştırma, hücrelerin nasıl davrandığını belirleyen proteinlerdeki kimyasal modifikasyonları incelemeye odaklanmaktadır. Bu durumda amaç, çeşitli substratları modifiye eden enzimlerin tercihlerini ve kinetiğini anlamaktır.

Maya yüzeyinde görüntülenen bir substrat molekülünün fosforilasyonunu giderme yeteneği ilk kez gösterilmiştir. Bu bulgu, daha önce erişilemeyen enzimatik modifikasyonların genelleştirilebilir kinetik haritalanması için olanaklar sunmaktadır. Bu araştırma, enzim substrat etkileşimlerini anlama ile ilgili zorlukları ele almaktadır. Tipik olarak, bu tür bir değerlendirme için hücre lizatları veya özelleştirilmiş peptitler gereklidir. Burada, maya ile görüntülenen substratların kullanılması yoluyla bir FasL alternatifi sağlanır.

Bu protokol, geleneksel maya yüzeyi ekranını, hücre dışı boşlukta normalde hücre içi enzimatik reaksiyonların analizine doğru ilerletir ve normalde değerlendirilmesi zor olan bu etkileşimlerin FasL analizini mümkün kılar.

Bu protokol, çeşitli enzimlerin substrat tercihlerini yüksek verimli yöntemlerle sorgulama ve basit bir okuma ile kinetik çalışmalar gerçekleştirme yeteneğini sağlar.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, hazırlanan maya hücrelerinin bir kısmını buz üzerinde çözdürün. Maya ekran yapısını içeren 0.5 ila 1.5 mikrogram plazmit DNA'yı doğrudan hücrelere ekleyin. Daha sonra 0.5 mililitre dönüşüm çözeltisi veya steril% 50 polietilen glikol ve 0.1 molar lityum asetat çözeltisi ekleyin. Hücrelerin, plazmid DNA'nın ve transformasyon çözeltisinin karışımını pipetleme ile iyice birleştirin. Dönüşüm karışımını 30 santigrat derecede 30 ila 60 dakika statik olarak inkübe edin ve karışımı 15 dakikalık aralıklarla girdaplayın. Hücreleri 1000G'de santrifüjleyerek hasat edin. 4.5 mililitre plazmid içeren maya hücresi büyümesi veya SDCAA ortamı içeren 14 mililitrelik bir kültür tüpü hazırlayın. İstenilen plazmidi içeren hücreleri 500 mikrolitre SDCAA'da yeniden süspanse edin ve hazırlanan 4.5 mililitre ortamı aşılayın. Beş mililitre aşılanmış kültürün 50 mikrolitresini, burguyu delmeden dikkatlice bir SDCAA plakasına dağıtın. Dönüşüm verimliliğini belirlemek için 48 saat boyunca 30 santigrat derecede statik olarak inkübe edin. Şimdi, beş mililitre SDCAA hücre kültürünü, en az 18 saat boyunca 30 santigrat derece ve 300 RPM'de çalkalama inkübatöründe inkübe edin. 16 saat sonra 600 nanometrede optik yoğunluğu izleyin ve 20 saat sonra tekrarlayın. Numune altıyı aşmayan bir optik yoğunluğa ulaştığında, kültürü 2500G'de üç dakika santrifüjleyin ve maya peletini bozmadan süpernatanı atın. Protein ekspresyonunun veya SRGCAA ortamının indüksiyonunda maya peletini, birden fazla nanometreden daha az 600 nanometrede nihai bir optik yoğunluğa yeniden süspanse edin. Maya kültürünü, 30 santigrat derece ve 300 RPM'de çalkalanan bir inkübatörde en az sekiz saat, ancak 24 saatten fazla olmamak üzere inkübe edin. Ardından hücre yoğunluğunu belirlemek için optik yoğunluğu 600 nanometrede ölçün. 2X çalışma tamponu çözeltisini 1,7 mililitrelik bir şişede deiyonize su ile bire iki oranında seyrelterek numuneler için çalışma tamponunu hazırlayın. Her numune için 1.7 mililitrelik şişeye iki milyon maya hücresini geri kazanmak için gereken uygun hacimde maya kültürü ekleyin. Şişeyi 4500G'de bir dakika santrifüjleyin ve bir mikro pipet kullanarak, süpernatanı biyolojik olarak tehlikeli atık olarak dikkatlice çıkarın ve atın. Santrifüjleme ve süpernatan çıkarma işlemini tekrarlamadan önce peletlenmiş hücreleri bir mililitre PBSA içinde yeniden süspanse edin. Bir kenara koyun. Rekombinant insan SHP-2 çözeltisini, 20 mikrolitrelik toplam reaksiyon hacminde 1.000 nanomollük bir nihai konsantrasyonda hazırlayın. Daha sonra, beş milimolar bir DTT çözeltisi oluşturmak için 15 mililitrelik konik bir tüpte 10 mililitre deiyonize suya 7.7 miligram DTT ekleyin. Şimdi, peletlenmiş hücreleri alın ve nihai reaksiyon hacmi numune başına 20 mikrolitre olacak şekilde çalışma tamponunda yeniden süspanse edin. 0.5 milimolar'lık bir nihai DTT konsantrasyonu için her numuneye iki mikrolitre beş milimolar DTT çözeltisi ekleyin. 20 mikrolitrelik bir son hacim elde etmek için hazırlanan SHP-2 hacmini her numuneye ekleyin ve bir mikro pipet kullanarak hafifçe karıştırın. Sızıntıyı veya çapraz kontaminasyonu önlemek için numune şişesi kapaklarını Parafilm ile sarın. Numuneleri 37 santigrat derecede iki saat boyunca sabit bir hızda bir rotor üzerinde inkübe edin. Numuneleri rotordan çıkardıktan sonra, bir dakika boyunca tekrar santrifüjlemeden önce her numuneye bir mililitre PBSA ekleyerek reaksiyonu durdurun. Sonra süpernatanı atın. Peletlenmiş numuneleri, karşılık gelen birincil reaktiflerinin 20 mikrolitrelik bir karışımında yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. 20 dakika sonra, numuneleri 4500G'de bir dakika santrifüjleyin ve süpernatanı biyolojik olarak tehlikeli atık olarak atın. Hücreleri tekrar santrifüjlemeden önce bir mililitre PBSA'da tekrar süspanse ederek bir kez yıkayın. Şimdi, numuneleri karşılık gelen ikincil reaktiflerinin 20 mikrolitrelik bir karışımında yeniden süspanse edin ve karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Numuneleri santrifüjledikten ve süpernatanı attıktan sonra, hücreleri tekrar santrifüjlemeden önce PBSA ile bir kez daha yıkayın. Daha sonra, yıkanmış numuneleri 300 ila 500 mikrolitre PBSA içinde yeniden süspanse edin ve akış sitometrisi analizi için beş mililitrelik polistiren tüplere aktarın. Sitometreyi hazırladıktan sonra, Dosya'ya tıklayın, ardından Yeni Deney düğmesine tıklayın, deneyi adlandırın ve elde edilen verilerin istenen dosya yoluna kaydedildiğinden emin olmak için Kaydet'e tıklayın. Her örnek için iki veya daha fazla nokta grafiği oluşturmak için üst araç çubuğundaki nokta grafiği simgesini seçin. Nokta grafiklerinden biri için, x ekseni adının FSCA kanalını ve y ekseni adının SSCA kanalını gösterdiğinden emin olun. Başka bir çizim için, birincil anti-epitop etiket antikorunu hedefleyen ikincil reaktifin floresan olduğu kanalı görüntülemek için x ekseni adını ve streptavidin ikincil reaktifinin floresan olduğu kanalı görüntülemek için y ekseni adını seçin. Tüpe sağ tıklayarak, Adı Düzenle'yi seçerek ve örnek adını girerek örnek için açıklayıcı bir ad sağlayın. Her bir numune tüpünü sitometrenin tutucusuna yerleştirin ve numuneyi yüklemeye ve veri almaya başlamak için Çalıştır'a tıklayın. Olayları, zamanı ve akış hızını gerektiği gibi ayarlayın. SSCA'ya karşı FSCA grafiğindeki sağlıklı maya hücrelerini çevreleyen bir geçit tanımlayın. Ardından tüm kontrol numunelerinin floresansını kaydedin. İşlem görmüş numuneleri analiz etmeden önce oluşturulan arsa için bir geçit stratejisi tanımlayın. Akış sitometrisi yazılımı kullanarak verileri analiz etmeden önce sitometreyi ve geçit stratejisini kullanarak fosforile edilmiş numunelerin floresansını kaydedin. Yüzeylerinde protein eksprese eden hücrelerin y ekseni medyanını ve numuneler ve kontroller arasında oynamayan hücreler tarafından sağlanan temel fosforilasyonu ölçerek ve karşılaştırarak fosforilasyonu değerlendirin. Son olarak, sağlanan formülü kullanarak yüzde medyan fosforilasyon farkını hesaplayın. Değişen SHP-2 fosfataz konsantrasyonlarının ve inkübasyon sürelerinin, maya yüzeyinde görüntülenen substratlardaki medyan fosforilasyon farkı üzerindeki etkisi bu şekilde gösterilmektedir. Yüzde medyan fosforilasyon farkı, tüm SHP-2 konsantrasyonlarında zamanla azaldı ve en yüksek defosforilasyon dört saatte 1.000 nanomolar SHP-2 konsantrasyonunda gözlendi. İki saatlik inkübasyondan sonra, 1.000 nanomolar SHP-2, aynı zaman noktasında 750 nanomolar durumdan önemli ölçüde daha düşük olan yaklaşık% 48.8 medyan fosforilasyon farkı ile sonuçlandı. İnkübasyon 500 nanomolar, 750 nanomolar ve 1.000 nanomolar SHP-2 konsantrasyonlarında iki saatten üç saate uzatıldığında medyan fosforilasyon farkında anlamlı bir fark gözlenmedi.