Gelişmekte Olan ve Olgun Arabidopsis Tohumlarında Endosperm Hücre Tabakasının Mikroskobik Analizi için Sağlam Dokunun Hazırlanması

Araştırma alanlarımızdan biri de tohum bilimidir. Endospermin tohum çimlenmesine nasıl katkıda bulunduğu sorusuna cevap vermeyi amaçlıyoruz. Tohum büyümesi inhibisyonu testi adı verilen bir in vitro test, tohum çimlenmesinde endospermin fizyolojik önemini ortaya çıkarmıştır. Arabidopsis tohumları oldukça küçüktür ve endosperm hücre tabakasının yeri, hücreler olan testisin altındadır. Endosperm örneklerini kimyasal olarak fikse edilmeden hazırlamak zordur. Endosperm analizinin önceki analizinde kimyasal olarak sabitlenmiş numuneler kullanılmıştı, bu nedenle organizma proteinlerinin hareketini gözlemleyemediler. Protokolümüz, endosperm hücrelerinin dinamiklerinin beş hücreli olarak görüntülenmesini sağlar. Protokolümüz standart laboratuvar ekipmanı kullanılarak gerçekleştirilebilir ve hücreler arası olay ve molekül mekanizmaları ile düzenli endosperm fonksiyonu hakkında daha derin bir anlayış sağlar.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, çiçeklenme aşamasına kadar Arabidopsis bitkilerini toprakta veya taş yünü üzerinde büyütün. Çiçeklenmeden sıfır gün sonra belirtmek için tamamen açılmış çiçekleri renkli ipliklerle işaretleyin. Bir sonraki prosedür için çiçeklenmeden 12 ila 16 gün sonra silikleri seçin. İnce makas kullanarak, pedicelde işaretlenmiş gelişmekte olan silisleri kesin ve 1,5 mililitrelik tüplerde toplayın. Kurumayı önlemek için diseksiyon için ıslak bir filtre kağıdı hazırlayın ve numuneyi stereo mikroskop altına yerleştirin. Biri tutmak için kalın uçlara sahip, diğeri yırtılmak için keskin uçlara sahip iki forseps kullanarak. Replum'dan bir valfi ayırın. Daha sonra forsepsleri uçları kapalı olarak kullanarak, onlara zarar vermemek için silislerden gelişmekte olan tohumları nazikçe toplayın. 27 gauge enjeksiyon iğnesi kullanırken, embriyoyu çevreleyen testa ve endosperm üzerinde yaklaşık 0,1 ila 0,2 milimetre boyutunda bir yara izi oluşturun. Tohumu ezmeden forseps ile tutun ve yara izini kotiledonların ve radikallerin birleştiği yerde yapın. Şimdi, tohumu forseps ile sıkıştırarak, tohum zarfını ezmemeye dikkat ederek ve yuvarlak şeklini koruyarak embriyoyu dışarı itin. Enjeksiyon iğnesini yara izindeki boş tohum zarfına sokun ve içten dışa doğru delin. Ardından, iğneyi yerinde tutun ve Testa'nın yüzeyini çizmek için kapalı uçlu forseps kullanın. Ardından açılmasına izin vermek için tohum zarfının bir tarafını kesin. Şimdi keskin uçlu forseps kullanarak tohum zarfını bir tabaka halinde açın. İzole edilen örnek şimdi endosperm ve Testa'dan oluşan iki katmanlı bir tabaka olmalıdır. Kuru Arabidopsis tohumlarını 1,5 mililitrelik bir tüpe koyun ve üzerine bir mililitre çift damıtılmış su ekleyin. Tohumları oda sıcaklığında en az 40 dakika emilmiş halde tutun. Diseksiyon için stereo mikroskop sahnesinde ıslak bir filtre kağıdı hazırlayın ve 1000 mikrolitrelik bir mikro pipet kullanarak, emilen tohumları ıslak filtre kağıdına aktarın. Şimdi numuneyi stereo mikroskop altına yerleştirin. Bir enjeksiyon iğnesi kullanarak, embriyoyu çevreleyen testa ve endosperm üzerinde yaklaşık 0.2 milimetre boyutunda bir yara izi açın. Tohumu ezmeden forseps ile tutun ve yara izi için kotiledon ile radikal arasındaki kavşağı hedefleyin. Şimdi tohumu forseps ile sıkıştırdıktan sonra embriyoyu dışarı itin. Boş tohum zarfını ezmekten kaçının ve yuvarlak şeklini koruyun. Bir enjeksiyon iğnesi kullanarak, silindirik bir formda şekillendirmek için boş tohum zarfının hem üst hem de alt taraflarını kesin. Ardından, silindirik tohum zarfını iki parçaya bölmek için merkezi ekseni boyunca kesin. Sonuçlar endosperm ve testadan yapılmış iki katmanlı tabakalar olmalıdır. İzole edilmiş endosperm örneklerini bir cam slayt üzerine tabakalar halinde yerleştirin ve suya monte edin. Son olarak, endosperm tabakasının kapak tabakasına doğru yukarı baktığından emin olarak numunenin üzerine nazikçe bir kapak fişi yerleştirin. Numuneyi mikroskop altında gözlemlemeden önce kapak kaymasının kenarlarını kapatmak ve kurumasını önlemek için oje veya gres kullanın. Çok sayıda endosperm hücresi ve hücre içi yapıları, belirlenen hazırlama protokolü kullanılarak çiçeklenmeden 14 gün sonra hasat edilen tohumlardan başarıyla görüntülendi. Endosperm hücrelerinin çekirdeğinin içinde, beyaz ışık altında PHYB-GFP'yi eksprese eden, varlıklarını ve nükleer lokalizasyonlarını doğrulayan foto cisimler tespit edildi. Endosperm hücreleri, diseksiyondan 4.5 saat sonrasına kadar PHYB foto geri dönüşümlülüğünü ve biyolojik aktiviteyi doğrulayan alternatif uzak kırmızı ve kırmızı ışığa maruz kalma üzerine geri dönüşümlü foto cisim oluşumu gösterdi. Üç saatlik tohum inhibisyonundan sonra sağlam endosperm hücrelerinde mitokondrinin floresan hızlandırılmış görüntülemesi yapıldı ve mitokondriyal hareket tespit edildi. Bir günlük tohum inhibisyonundan sonra endosperm hücrelerinde daha dinamik mitokondriyal motilite gözlendi, bu da zamanla aktivitenin arttığını gösteriyor.