AAV2'nin Subaraknoid Enjeksiyonu ile Fare Neokortikal Nöronlarının Yaygın Transdüksiyonu

Araştırmamız, fare neokorteksinde büyük hacimli nöral dokunun viral transdüksiyonuna izin veren yöntemi geliştirmeye odaklanmıştır. Tipik olarak, viral partiküllerin süspansiyonu doğrudan beyin parankimine enjekte edilir. Burada alan transfeksiyonu, sınırlı bir aralığa sahip olan beyin dokusundaki viral partiküllerin difüzyonu ile belirlenir.

AAV2 viral vektör virüslerini beyin yüzeyi yoluyla subaraknoid boşluğa enjekte ediyoruz. Virüsün subaraknoid uygulamasının, intraparankimal enjeksiyona kıyasla enfeksiyon alanında neredeyse dört kat artışa yol açtığını bulduk. Yeni teknik, yetişkin farelerde neokortikal nöronların yaygın transdüksiyonunu sağlar ve nöronal aktivitenin sonraki optik veya elektrofizyolojik kayıtları için beyin dokusunun korunmasına yardımcı olur.

Enjeksiyon yöntemimiz, seçici olmayan güçlü bir promotör kullanıldığında bile, büyük bir popülasyon katmanı beş piramidal nöronda transgenin seçici ekspresyonuna izin verir. Ancak, bu seçiciliğin mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Başlamak için, anestezi uygulanmış bir farenin ön dişlerini diş çubuğuna sabitleyin ve hayvan maskesini takın.

Fareyi dikkatlice kulak çubuklarının üzerine yerleştirin. Kafayı gözlerden kulakların arkasına kadar tıraş edin, ardından traş edilmiş yüzeyi %70 etanol ve ardından %5 alkol iyot çözeltisi ile temizleyin. Topikal olarak steril %4 lidokain solüsyonu uygulayın ve ağrı ve iltihabı azaltmak için deri altına 0,02 mililitre deksametazon enjekte edin.

Steril bir neşter ve makasla, kafa derisini açmak için kulakların arasından başlayarak dört ila beş milimetrelik bir orta hat kesisi yapın. Kafatasına zarar vermemek için kesiği makas kullanarak genişletin. Bregma ve lambda'yı görselleştirmek için kafatası yüzeyini %3 hidrojen peroksit ile silin.

Reaksiyonu hemen %0,9 sodyum klorür salin ile durdurun. Ardından kafatası yüzeyinden dokuyu çıkarmak için bir kemik kazıyıcı kullanın. Önceden hazırlanmış motorlu enjektörü bir Hamilton şırıngası ile stereotaksik kola monte edin.

Cerrahi bir ışık kaynağı kullanarak açıkta kalan kafatasını aydınlatın ve mikroskobu bregmaya odaklayın. Mikroskoptan bakarak, iğne ucunu doğrudan bregma üzerine hizalamak için stereotaktik kolu hareket ettirin. İğne ucunu kullanarak bregma ve lambda'yı yatay olarak hizalayın.

Bregma'ya dönün ve koordinatları kaydedin. İğneyi hesaplanan koordinatlara getirin. Yeni konumuna indirin ve işaretleyin.

Viral yayılmayı göz önünde bulundurarak hedefin yakınında viral enjeksiyon bölgesini seçin. Şimdi, mikroskopla bakarken küçük bir kraniyotomi oluşturmak için 0,5 ila 0,8 milimetre çapında steril bir diş çapağı kullanın. Kemik tozunu uzaklaştırmak için basınçlı hava kullanın.

Deliği steril tuzlu su ile yıkayın ve fazlalığı pamuklu çubukla alın. Ardından, duraya zarar vermemeye dikkat ederek kalan kemiği çıkarmak için kanca şeklinde uçlu 27 gauge bir iğne veya ince cımbız kullanın. Kafatasını steril tuzlu suyla nemlendirilmiş bir kağıt havluyla örtün.

Ardından, kafatası yüzeyinin üzerine steril şeffaf bir film yerleştirin. Stereotaksik kolu geriye doğru hareket ettirin ve mikro şırınga iğnesini şeffaf filmin üzerine hizalayın. Ardından iki mikrolitre kalana kadar fazla yağı dağıtın.

Viral enjeksiyon hacmini ve diğer iki mikrolitre virüsü şeffaf filme pipetleyin. Mikroskoptan bakarak, iğne ucunu virüs damlasının ortasına indirin. Şimdi virüsü motorlu bir enjektörle mikro şırıngaya yükleyin.

Nemlendirilmiş kağıdı kafatasından çıkarın ve bölgeyi pamuklu çubukla kurulayın. Stereotaksik kolu ve iğneyi yerleştirme bölgesinin üzerine yeniden konumlandırın. Ardından, iğne tıkanıklığını kontrol etmek için bir damla virüs dağıtın.

Kanca şeklinde uçlu 30 gauge iğne kullanarak durada küçük bir yarık açın. Şırınga iğnesini duraya indirin ve yüzey temas noktasına göre yerleştirme derinliğini hesaplayın. İğneyi kortekse yavaşça 300 mikrometre derinliğe sokun, iki ila üç dakika bekleyin, 200 mikrometreye geri çekin ve iki ila üç dakika daha bekleyin.

Toplam bir mikrolitre için viral enjeksiyona dakikada 0,06 mikrolitrede başlayın. İnfüzyondan sonra, virüsün dağılmasına izin vermek için iğneyi 10 dakika hedef bölgede tutun. Ardından geri akışı önlemek için iğneyi yavaşça geri çekin.

İğnenin tıkalı olmadığını doğrulamak için bir damla virüs dağıtın. Saçlı deri kesisini 5-0 emilebilir veya emilmeyen dikiş kullanarak kapatın. Bir AAV2'nin subaraknoid uygulaması, hem mediolateral hem de rostrokaudal yönlerde yaklaşık dört kat genişleme ile geleneksel intrakortikal enjeksiyona kıyasla önemli ölçüde daha geniş bir nöronal enfeksiyon alanına yol açtı.

Subaraknoid virüs enjeksiyonu, kortikal katmanlar ikinci, üçüncü ve beşteki nöronların güçlü yeşil floresan etiketlemesi ile sonuçlanırken, dördüncü ve altıncı katmanlar etiketli hücre gövdeleri göstermedi, ancak sırasıyla görünür dendritler ve aksonlar gösterdi. Subaraknoid enjeksiyon sırasında enjekte edilen virüs süspansiyonuna eklenen floresan partiküller beyin yüzeyi boyunca bulundu, bu da virüsün beyin omurilik sıvısı yoluyla yayıldığını ve nöronal etiketlemeden daha geniş yüzey kapsamına sahip olduğunu gösteriyor. Ön bölümlerde yeşil floresansın geniş yüzey dağılımı, standart enjeksiyonda görülen küçük lokalize enfeksiyonun aksine, subaraknoid enjeksiyonu takiben yaygın kortikal enfeksiyonu doğruladı.

Süper granüler katmanlarda, transdüksiyona tabi tutulan nöronların önemli bir kısmı parvalbümin veya kalbindin ile birlikte eksprese edilirken, beşinci katmanda birlikte etiketlenmiş internöronlar tespit edilmedi ve tüm enfekte hücreler yalnızca piramidal nöronlar tarafından temsil edildi.