Hücrelerin Hedeflenen Frezelenmesi için Kriyojenik Tesadüfi Floresan, Elektron ve İyon Işını Mikroskobu Kullanan İş Akışı
17 Ekim 2025
Bu iş akışı, kriyojenik üç tesadüfi görüntüleme platformu kullanarak küçük (eksenel kapsamda <1 μm) ve nadir (hücre başına 1 kopya) floresan etiketli biyolojik yapıları hedefleyen lamel üretimini mümkün kılar. Bu platform, floresan mikroskobu, odaklanmış iyon ışını frezeleme ve taramalı elektron mikroskobunu tek bir odak konumunda birleştirir ve frezeleme sırasında eş zamanlı floresan mikroskobuna olanak tanır.
Araştırmam, odaklı iyon ışını frezelemesi sırasında kriyojenik lamellerde hücresel özellikleri korumak için optik mikroskopi yöntemleri geliştirir; bu yöntem, kriyojenik elektron tomografi ile ayrıntılı analizlerin doğal biyolojik organizasyonu ortaya çıkarmasını sağlar. Optik mikroskopi, CryoFIB-SEM sistemlerine entegre edilmiştir, ancak nadiren FIB ile aynı konumda olur. Bu, son lamellada floresan işaretli hedeflerin korunması için kayıt temelli rehberlik yaklaşımlarını gerektirir.
Başlamak için, aşama kriyojenik sıcaklıklara ulaştığında transfer istasyonunu sıvı azot kullanarak manuel olarak soğutun. Kriyojenik ışık mikroskopisi sistemi için tasarlanmış örnek kasetine bir kesilmiş otomatik ızgara yükleyin. Otomatik ızgaranın yapıştırılmış kapak kayağı ile ara parça arasında konumlandırıldığından emin olun.
Kaseti kapatmak için halka vidasını sıkar ve transfer istasyonundaki yuvaya tak. Transfer istasyonunu kriyojenik ışık mikroskopisi sistemine bağlayın. Dahili kamera kullanarak örnek kaseti örnek aşamasına yönlendirin.
Işık mikroskopisi yazılımında, örnek aşamasını yükleme pozisyonundan önceden tanımlanmış üç ışın pozisyonuna taşıyabilirsiniz. FIB-SEM yazılımında büyütmeyi 100X olarak ayarlayın ve sol üst pencereye tıklayın. Işık mikroskopisi yazılımının hizalama sekmesinde, Z tuşuna tıklayın ve Oynat fonksiyonunu seçerek ızgaranın SEM atlasını edinin.
Kırık karbon filmi olan kare bir alanı belirleyin ve örnek aşamasını o konuma taşımak için üzerine çift tıklayın. Yazılım arayüzüne geri dön. FIB'i etkinleştirin ve bir görüntü alın.
Büyütmeyi sol üst köşedeki açılır menüyle ayarlayın. FIB görsesini göstermek için Play tuşuna basın. Sonra kaydırma çubuğu ile adım boyutunu ayarlayın.
Şimdi Z ve Z tuşlarına tıklayarak aşama Z konumunu ayarlayın, iyon ve elektron görüntülerindeki yatay çizgi aynı özellikle hizalanana kadar. Işık mikroskopisi yazılımında SEM sekmesini seçin. SEM ve ion görüntüleri arasında ortak bir özelliği hizalamak için or X ve Y tuşlarını kullanın.
Şimdi floresan mikroskobu açın. FLM sekmesini seçin, yansıtılan ışık görüntüleme koşullarını ayarlayın ve Oynat'ı seçin. Sonra yansıtılan ışık görüntüsünü SEM görüntüsüyle hizalayın.
Görüntüye yakınlaştırın ve dikdörtgen seçeneğine tıklayarak iyon ışını için frezeleme desenini tanımlayın. Ekranda Start Patterning tuşuna basarak odaklı iyon ışınını kullanarak küçük bir desen frezeleyin. Frezeli desenin hem odaklı iyon ışını hem de floresan mikroskop görünümünde görülebileceğini doğrulayın.
Işık mikroskopisi yazılımında, Yerelleştirme sekmesine geçin ve floresan kanalları kurmak için uygun koşulları etkinleştirin. Her floroforu ayrı bir kanala atayın ve parlak alan için ek bir kanal ekleyin. İlgilendiğiniz hedefi belirlemek için her floresan kanal için LED gücünü ve pozlama süresini ayarlayın.
Parametreler tatmin edici olduğunda, eksenel yönden adım atarak frezeleme öncesi bir floresan z-stack edinin. Sonra hedefi ilgi alanı olarak işaretleyin. FIB-SEM yazılımına geçin ve ilgi alanınızda lamella çizin.
Toplu malzemeyi çıkarmak için kaba frezeleme yapın ve floresan mikroskobu açık tutup sinyal değişikliklerini izleyin. Lamella inceltme sırasında floresan sinyali izlemek için terminalden Python tabanlı interferometrik araç setini açın. Yatırım getirisi yaklaşık iki mikrometreye kadar inceltin ve temizlik kesit modunu kullanın.
300 nanometrenin üzerinde eksenel kapsama sahip bir hedef için, Python GUI'de floresans mikrografında hedef seçilir. Yazılım, her yeni kare ile parlaklığı zaman fonksiyonu olarak otomatik olarak çizmeye başlar. Floresans yoğunluğunu Python araç seti üzerinden izleyin.
Numuneyi, ilgilenilen bölgenin altındaki kalan destek filmini temizleme kesit modunda öğütmek için öğütün. Frezeleme yönünü değiştirmek için aniden floresans yoğunluğundaki düşüşleri gözlemleyin. Aşağıdan yukarıya frezeleme sırasında keskin bir azalma gözlemlenirse, durun ve yukarıdan aşağıya frezemeye başlayın.
Üstten aşağıya frezeleme tamamlandıktan sonra, lamelayı temizleme kesit modunda aşağıdan yukarıya frezeleme ile tamamlanarak istenen kalınlığa ulaşın. Sonra frezeleme sonrası lamelin floresans görüntüsünü çekin. Örneği bir CryoTEM'e aktarın.
Frezeleme sonrası çok kanallı floresan görüntüsünü ve CryoTEM projeksiyon görüntüsünü özel projeksiyon dönüşüm yazılımına yükleyin, ilgi alanının kaydı için oluşturulur. Şimdi, hem floresans hem de elektron mikroskopi görüntülerinde görülebilen sekiz ila 10 çift referans noktası seçerek projeksiyon dönüşümünü hesaplayın. Bir görüntüleme alanı seçmek için üst üste bükülmüş görüntüyü rehber olarak kullanın.
Sonra, hedef yapısının boyutuna ve istenen çözünürlüğe bağlı olarak eğim serisi için uygun büyütme ve alım parametreleri seçilir. SiR-Tubulin ile etiketlenmiş farklılaşmış makrofaj hücreleri, MTOC'ya karşılık gelen yaklaşık bir mikrometre çapında tek bir parlak floresan noktam ve mikrotübul ağına uygun hücre çevresine yayılan fibro-benzeri yapılar sergiliyordu. Örnek yaklaşık 800 nanometre kalınlığında öğütüldüğünde, tekil floresan MTOC punctum yaklaşık 700 nanometre çapında iki ayrı noktaya ayrıldı.
Flüoresan olmayan hacimli materyal ve emici destek filmi çıkarıldıktan sonra floresans yoğunluğu arttı, ardından lamella iki mikrometreden 200 nanometrenin altına daha da inceltildikçe keskin bir azalma yaşandı. Bağlantılı kriyojenik floresans ve elektron mikroskopi, frezeleme sırasında yapıların hassas hedeflenmesini mümkün kılmıştır. Rekonstrüklenmiş tomogramlar ve segmentli modeller, merkezilerin mikrotübul üçlemelerinden oluştuğunu ortaya koyar.
Son lamellada sadece bir floresan benek kaldığı durumlarda, karşılık gelen tomogramda tek bir santriol görselleştirildi. Milimilling'e dayalı floresans doğruluğu, difraksiyon sınırlı çözünürlük, kırılma indisi uyumsuzluğu ve frezeleme kaynaklı hareket gibi kayıt yaklaşımlarıyla sınırlıdır. Eşzamanlı optik mikroskopi ve FIB frezeleme, frezeleme sürecini yönlendirmek için floresan mikroskopiden alınan gerçek zamanlı geri bildirim kullanılarak kayıt hatalarını ortadan kaldırır.
Bu, kırınım sınırı ve kırılma indeksi uyumsuzluğu nedeniyle oluşan hataları önler; böylece son lamel içinde kriyoelektron tomografisi için floresan işaretli yapıları koruyan hassas frezeleme mümkün kılar. Araştırmalarımız, daha önce doğrudan görselleştirmesi zor olan hücresel yapıları cryoET ile görselleştirmeyi mümkün kılarak, çok çeşitli önemli mikromoleküler makinelerin ardındaki moleküler mekanizmalara ışık tuttu.
Genel Bakış
Bu iş akışı, küçük ve nadir bulunan floresan olarak etiketlenmiş biyolojik yapıları hedefleyen kriyojenik lameller üretimini sağlar. Tek bir fokal pozisyonda floresans mikroskobu, odaklanmış iyon demeti frezeleme ve taramalı elektron mikroskobunun entegrasyonu eşzamanlı görüntüleme ve frezeleme sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Sinirbilim
- Biyofizik
- Mikroskop Teknikleri
Arka Plan
- Optik mikroskopi yöntemleri, frezeleme sırasında hücresel özelliklerin korunması için gereklidir.
- Floresans mikroskobunun CryoFIB-SEM sistemlerine entegrasyonu nadirdir.
- Floresan olarak etiketlenmiş hedefleri korumak için kaydı temel alan kılavuzluk gereklidir.
- Doğal biyolojik organizasyonun anlaşılması ayrıntılı analiz için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Kriyojenik lamellerde hücresel özelliklerin korunması yöntemlerini geliştirmek.
- Kriyojenik elektron tomografisi ile ayrıntılı analiz sağlamak.
- Frezeleme sırasında floresan yapıların hedeflenmesinin doğruluğunu artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Transfer istasyonunun sıvı nitrojen kullanarak manuel soğutulması.
- Floresans mikroskobunun FIB-SEM sistemleri ile entegrasyonu.
- Frezeleme öncesi floresan z-stacklarının elde edilmesi.
- Frezeleme sırasında bir Python araç kiti kullanarak floresans yoğunluğunun izlenmesi.
Ana Sonuçlar
- Floresan olmayan hacimsel malzemenin çıkarılmasından sonra floresans yoğunluğu arttı.
- Korele kriyojenik floresans ve elektron mikroskobu, hassas hedeflemeyi sağladı.
- Yeniden yapılandırılmış tomogramlar, sentriollerin yapısını ortaya çıkardı.
- Bazı durumlarda tek sentriol görselleştirmesi sağlandı.
Sonuçlar
- Çalışma, kriyojenik lamella üretimi için etkili yöntemler göstermiştir.
- Floresans tabanlı hedefleme, yapısal analizin doğruluğunu artırır.
- Görüntüleme tekniklerinin entegrasyonu, biyolojik organizasyonun anlaşılmasını geliştirir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Simultaneous cryogenic fluorescence, electron, and ion beam microscopy enables precise, real-time targeting of rare cellular structures during lamella preparation for cryo-electron tomography. This workflow eliminates registration errors and enhances the preservation of disease-relevant subcellular features, directly impacting early discovery and mechanistic de-risking. The approach supports higher predictive confidence in structural biology pipelines and facilitates risk-adjusted portfolio decisions for complex biological targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and preservation of fluorescently labeled subcellular targets during sample preparation.
- Reduces ambiguity in mechanistic studies by maintaining structural integrity of rare or small features.
- Improves predictive confidence for target validation by correlating fluorescence with ultrastructural data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated lamellae for downstream high-resolution imaging and quantitative analysis.
- Supports reproducible sample preparation by integrating real-time fluorescence feedback during milling.
- Facilitates standardization of workflows for screening rare cellular events or phenotypes.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural preservation with translational biomarker discovery when fluorescent labels mark disease-relevant features.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by supporting correlative imaging strategies.
- De-risks advancement decisions by providing high-fidelity structural data on targets of interest.
Pipeline & Workflow Integration
This tri-coincident imaging workflow integrates at the interface of discovery biology and structural analysis, bridging early target validation with preclinical model characterization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling direct observation of labeled structures during milling.
- Screening: Provides reproducible, quantitative lamella preparation for downstream imaging assays.
- Analytics: Delivers real-time fluorescence intensity measurements to guide and document sample processing.
- Translational Research: Maintains alignment between molecular labeling and ultrastructural readouts for biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, standardized workflow for targeting diverse cellular structures across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in structural biology.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization of lamella preparation for high-resolution imaging.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust structural data on rare targets.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on direct structural evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryogenic microscopy, fluorescence imaging, and focused ion beam operation.
- Demands integrated instrumentation capable of simultaneous tri-modal imaging and milling.
- Necessitates cross-team standardization of imaging parameters and sample handling protocols.
- Adaptation may be needed for different cell types or labeling strategies.
- Practical limitations include fluorescence signal stability and potential milling-induced motion artifacts.
