Bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin Sentezi: Çekirdek Hücrelerin Biyomimetik Bir Modeli

Bu makale, iç, halka ve dış bölgelerde özelleştirilmiş elektriksel iletkenliğe sahip, vezikül içinde vezikül yapısına sahip bileşik Dev Unilamellar Veziküllerin (cGUV'ler) hazırlanması için bir yöntem sunar. Elektroformasyon, ozmotik şok yoluyla stomatositlere ve cGUV'lara dönüştürülen basit GUV'leri sentezler ve çekirdekli hücrelerin biyofiziğini incelemek için değerli bir model sağlar.

Bileşik dev tek katmanlı veziküllerin sentezi ve elektro hidrodinamiği üzerine, onları ökaryotik hücrelerin biyomanyetik eşdeğerleri olarak belirlemek için ayrıntılı bir çalışma yürüttük. Girişim, hücre elektroporasyonu ve hücre elektrodeformasyonu gibi elektrik alanının biyolojik hücrelere uygulanmasını içeren teknolojileri anlamaktır.

Bu alandaki araştırmaları ilerletmek için floresan ve ışık mikroskobu, nanosaniye darbeli elektrik tedavileri, osiloskop ve güç kaynakları ve yenilikçi sentez yöntemlerinin bir kombinasyonu kullanılmaktadır. İyi biçimlendirilmiş bileşik GUV'ların sentezindeki zorluk, bir yöntemin bir sıcaklığa, lipit türlerine ve kullanılan bileşime duyarlılığıdır. Bu çalışmada, bunu bir DMPC ve kolesterol sistemi için gösteriyoruz, ancak genelleştirmek zor olmaya devam ediyor. Literatürde nükleik hücreleri taklit eden basit GUV'lar sentezlenmiştir. Dış vezikülün kabaca yarısı büyüklüğünde bir iç vezikülü çevreleyen, valf savunma yapısına sahip çekirdekli bir hücreyi taklit etmek için bileşik dev vezikülü sentezliyoruz.

Elektroporasyon bağlamında biyolojik bir hücrenin çekirdeğini taklit eden mikro ve nanosaniye darbelerin iç vezikül üzerindeki etkisini incelemeye odaklanacağız.

[Anlatıcı] Başlamak için, indiyum kalay oksit veya ITO kaplı slaytları bir bulaşık deterjanı çözeltisi kullanarak iyice temizleyin ve santimetre başına 0,055 mikrosiemens iletkenliğe sahip deiyonize su ile durulayın. Daha sonra %100 etanol solüsyonu kullanarak slaytları tekrar temizleyin ve deiyonize su ile durulayın. Slaytları 85 santigrat dereceye ayarlanmış bir fırında kurutun. Bir pens ampermetre kullanarak her ITO kaplı kızağın iletken tarafını tanımlayın. Temiz slaytı bir vakum kullanarak döndürme kodlayıcı aşamasına sabitleyin ve iletken tarafın yukarı baktığından emin olun. Bir ITO slaytının iletken tarafına 25 mikrolitre lipit çözeltisi uygulayın, biri dört damlacıktır. Başka bir slayt alın ve 25 mikrolitre lipid solüsyonunu aynı şekilde iki uygulayın. Her iki lipit kaplı slaytı da karanlıkta en az iki saat saklanan bir desikatörde vakumla kurutun. Ardından, iletken kenarların birbirine bakmasını sağlayacak şekilde, temiz bir slayta paralel olarak lipit kaplı bir ITO slaytı düzenleyin ve aralarına üç milimetre kalınlığında bir silikon kauçuk ara parçası yerleştirin. Bir elektroformasyon odası oluşturmak için kurulumu bir kelepçeyle kapatın. Şimdi hazneyi iki mililitrelik bir şırınga kullanarak 100 milimolar sakaroz çözeltisiyle doldurun. Fonksiyon üretecinin çıkış kablosunu fonksiyon üreteci ile ITO kaplı kızaklara bağlayın. Her iki elektroformasyon odasını da 38 ila 40 santigrat derece arasında tutulan bir inkübatöre yerleştirin. Dört saat boyunca çift kanallı bir fonksiyon üreteci kullanarak 10 hertz frekansında tepeden tepeye beş voltluk bir alternatif akım elektrik alanı uygulayın. İnkübasyondan sonra, elektroformasyon odalarını fonksiyon üretecinden ayırın. Bunları inkübatörden çıkarın ve oda sıcaklığına soğumalarını bekleyin. Bir şırınga kullanarak, sentezlenen dev tek katmanlı vezikülleri her odadan toplayın ve bunları ayrı iki mililitrelik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Ozmotik şoka geçmeden önce tüpleri 25 ila 27 santigrat derece arasındaki oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. 100 milimolar sükroz çözeltisi içeren nemlendirici ortamda süspanse edilmiş 200 mikrolitre basit dev tek katmanlı vezikülleri veya sGUV'ları gözlem odasına aktarın ve ozmotik şoku indüklemek ve şekil geçişlerini başlatmak için 125 mikrolitre 300 milimolar glikoz çözeltisi ekleyin. Şu anda ozmotik şoka maruz kalan sGUV'ların mikroskopi aşamasına yerleştirilen gözlem odasında bir saat dinlenmesine izin verin. Tek renkli bir kamera ile donatılmış ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak diferansiyel girişim kontrastı ve epifloresan mikroskobu gerçekleştirin. sGUV'lardaki şekil geçişlerini gözlemlemek için Plan Fluor ekstra uzun çalışma mesafesi 20X x 0,45 ve 40X x 0,60 objektif lensleri kullanın. Epifloresan için, 510 ila 560 nanometrede uyarma ile yeşil bir filtre seti, 575 nanometrede bir dikroik ayna ve Niall Red lekeli çift katmanlar için 590 nanometrede bir bariyer filtresi kullanın. Plan Fluor objektif lensleri ile diferansiyel girişim kontrastı ve epifloresan mikroskobu kullanarak gözlem odası içindeki şekil geçişlerini izleyin. Şekil geçişi ilerledikçe stomatositik veziküllerin oluşumunu gözlemleyin. Önce daha büyük veziküllerin nasıl yerleştiğini, ardından zamanla daha küçük veziküllerin sayısındaki artışı izleyin. Daha sonra, ozmotik şoku indüklemeden önce cGUV'ların farklı bölgelerindeki iletkenliği ayarlamak için tuz çözeltisi ekleyin. Örneğin, dış ve iç bölgelerde halka şeklindeki bölgeye göre daha yüksek iletkenlik oluşturmak için 200 mikrolitre sükroz çözeltisini elektrofüzyon odasına aktarın. Hazneye 20 mikrolitre 7.5 milimolar tuz çözeltisi ekleyin ve 125 mikrolitre 300 milimolar glikoz çözeltisi ile ozmotik şoka neden olun. Ozmotik şok sGUV'larının odada üç ila dört saat dinlenmesine izin verin. Ortaya çıkan cGUV'ların halka şeklindeki bölgeye kıyasla dış ve iç bölgelerde daha yüksek iletkenliğe sahip olduğunu doğrulayın. cGUV'ların elektrodeformasyonunu gerçekleştirmek için, tel elektrotları 500 mikrometre aralıklarla yerleştirin ve bir fonksiyon üreteci kullanarak 100 kilohertz'de tepeden tepeye 7,5 voltluk bir alternatif akım elektrik potansiyeli uygulayın. Elektrik alanı uygulandıktan sonra saniyede 10 kare hızında video çekin ve dış veziküllerin basık deformasyonunu ve iç veziküllerin prolate deformasyonunu gözlemleyin. Ardından cGUV karışımını bir boşluk kızağına yükleyin ve hareketi önlemek için bir lamel ile kapatın. Bir mikrometre adım boyutuyla Z ekseni taraması yoluyla cGUV morfolojisini analiz etmek için bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanın. Görüntüleme için bir Plan Apochromat 40X x 1.3 yağlı DIC objektif lensi kullanın. Niall Red veya Rhodamine PE ile boyanmış cGUV'yi görüntülemek için 561 nanometre uyarım ve 561 ila 695 nanometre emisyonlu kırmızı tek kanallı mod kullanın. öğesini değiştirin ve çıkarın. Mikroskop bağlantılı yazılımı kullanan CZI görüntü dosyası. Ölçek çubukları gibi grafikler ekleyin ve 2B ve 3B görünümleri etkinleştirin. Daha sonra istediğiniz ayarları yapmak için işleme yöntemi ve parametrelere gidin. Ardından görüntüyü JPG formatında dışa aktarmak için Uygula'yı tıklayın. Son olarak, dosyayı ImageJ yazılımında açın. Ölçek çubuğu eklemek için analiz et'e gidin, ardından kalibre edilecek ölçeği ayarla'yı seçin, ardından analiz et'i ve ardından uygulamak için araçları ve ölçek çubuğunu seçin. Konfokal Z-yığını görüntüleme, iç veziküllerin dış veziküllerden tamamen ayrıldığını ve iç çözeltinin daha düşük yoğunluğu nedeniyle Z düzleminde yükseldiğini doğruladı. Ara stomatosit durumu, tamamen ayrılmadan önce iç ve dış vezikülleri birbirine bağlayan dar bir boyun gösterdi. Ozmotik şoktan altı saat sonra çoklu iç veziküller, yıldız şeklindeki cisimler ve boru şeklindeki yapılar dahil olmak üzere çeşitli veziküler form popülasyonu gözlemlendi. 63 ila 37 molar oranda 1,2-Dimiristoil-sn-glisero-3-fosfokolin ve kolesterolden oluşan bir lipid karışımı kullanılarak yüksek miktarda cGUV oluşturuldu. Alternatif akım elektrik alanı altında, cGUV'lar, dış vezikülün basık bir şekil oluşturması ve iç vezikülün prolate bir şekil oluşturmasıyla deformasyon gösterdi.