Fibrozisli Metabolik Disfonksiyonla İlişkili Steatotik Karaciğer Hastalığının Fare Modeli

Araştırmamızda, metabolik işlev bozukluğuna bağlı steatotik karaciğer hastalığı (MASLD) üzerine odaklanıyoruz ve özellikle lipid birikimi ve fibroz mekanizmalarına odaklanıyoruz. Son gelişmeler arasında tek hücreli ve özel transkriptomikler, hayvan MASLD modellerinin standartlaştırılması ve MASLD tedavisinde semaglutidin onayı yer almaktadır. MASLD'nin birçok hayvan modeli var, ancak birçoğunun karaciğer fibrozunu tetiklemediğini gördük.

Bu noktayı ele almak için MASLD fare modelimizi geliştirdik. Fare modelimiz, hiperfagik farelere ortalama Amerikan diyetine benzer bir diyet vererek fibrozli MASLD'yi indükler. Bu, insanlardaki hastalığa çok benzer bir MASLD'ye neden olur.

Yöntemimiz, MASLD'nin patofizyolojisi üzerine çalışmaları ve yeni tedavilerin test edilmesini kolaylaştıracaktır. Başlamak için, bir slayt üzerinde parafinle gömülü bir karaciğer dokusu kesiti alın. Parafinizasyondan uzaklaştırmak için, slaytı ksilen veya sitrisolyumda beş ila 15 dakika batırın.

Sonra bölümü seri olarak 100, 95 ve %70 etanol ile yeniden nemlendirin, ardından her birinde beş dakika damıtılmış su ile sürün. Sonra bölümü Sirius Red ile boya ve sürgü kurut. Temizleme çözeltisinden birer bir slayt çıkarın ve fazla sıvıyı çıkarmak için kağıt havluya sürürün.

Bölüme yaklaşık 50 ila 100 mikrolitre montaj ortamı ekleyin. Bölümü bir kapak slipiyle kapatın ve hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe bastırın. Sürgü havada kurutulsun.

Şimdi, hazırlanan bölümü 4x ila 20x objektiflerle parlak alan aydınlatmasıyla ışık mikroskobu altında gözlemleyin. Yaklaşık 500 ila 1000 mikrolitre karaciğer homojenatını 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın ve trikloroasetik asit ekleyerek %12 konsantrasyona ulaşın. Tüpü kısa bir süreliğine vortex ile içeriği karıştırın. Tüpü buzlu su banyosunda 30 dakika kuluçka yapın ve 6.000 g sıcaklıkta, dört derece Celsius'ta 10 dakika santrifüjle yapın.

Sonra süpernatantı pipetle çıkarın. Pelleti yıkamak için bir mililitre %100 buz soğukluğu etanol ekleyin ve sonikasyon ile iyice tekrar süsleyebilirsiniz. Süspansiyonu tekrar santrifüj ettikten sonra, süspansiyonu aspire edin.

Üçüncü yıkamadan sonra, tüpü açık tutup pelleti gerektiğinde 10 dakika veya daha uzun hava kurutma için. Daha sonra protein pelletini içeren tüpe 800 mikrolitre 6 normal hidroklorik asit ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi bir sonikatör kullanarak pelleti yeniden askıya alın. Süspansiyonu vidalı kapaklı cam tüp veya şişeye aktarın ve kapağı sıkıca kapatın.

Tüpü 110 derece Celsius sıcaklığında fırında yaklaşık 22 saat kuluçka edin. Gerekirse, cam şişeden içeriği spin yapmadan önce santrifüj tüpüne aktarın. Hidrolize edilmiş örneği 16.000 g ile 10 dakika boyunca santrifüjle edin ve hidroksiprolin içeren süpernatantı 1,5 mililitrelik bir tüpte aspire edin.

Hidroksiprolin oksidasyonu için, 50 mikrolitre numune ve standart içeren tüplere 450 mikrolitre kloramin çözeltisi ekleyin. Tüplerdeki içeriği bir girdap ile karıştırın ve oda sıcaklığında 25 dakika kuluçka yapın. Sonra her numuneye ve standarda 500 mikrolitre Ehrlich reaktifi ekleyin.

Vortekslemeden sonra, örnekleri 65 derece Celsius sıcaklığında 20 dakika kuluçka içinde kuluçka yapın. İnkubasyondan sonra, tüplerin oda sıcaklığına soğumasına izin verin ve örneklerin son rengi gözlemlenir. Son olarak, 550 nanometre dalga boyunda bir spektrofotometre kullanarak örneklerin ve standartların emilimini ölçebilirsiniz.

Picro Sirius Red ile karaciğer dokusunun kollajen boyamasında parlak alan aydınlatmasıyla gözlemlendiğinde, açık turuncu veya sarı arka plana sahip kolajen kırmızısı gösterildi. Fibroza karşılık gelen kolajen birikimi ve kan damar duvarları, hilum ve karaciğer kapsülü kolajen ile boyanmıştır. Polarize ışık mikroskobusi, koyu zeminde belirgin çift kırılan kolajen lifleri ortaya koyarak fibrozun görselleştirilmesini artırdı.

Yüksek yağ ve fruktoz diyetiyle (HFFD) beslenen agouti sarı farelerde karaciğer kollajen pozitif alanının nicelendirilmesi, düşük yağlı ve fruktozlu diyetle beslenen vahşi tip kontrol farelerine kıyasla fibrozun anlamlı derecede yüksek olduğunu gösterdi. Karaciğer hidroksiprolin içeriğinin nicelendirilmesi, HFFD diyetiyle beslenen agouti sarı farelerde diyetin 16 haftasından sonra kontrol farelerine kıyasla anlamlı derecede daha yüksek bir seviye gösterdi ve fibrotik karaciğerlerde kolajen birikiminin arttığını doğruladı.