Mini İnme Murin Modelinde Nöroimmün Etkileşimlerin İzolasyonu ve Flow Sitometrik Değerlendirmesi

Araştırmamızın kapsamı, iskemik inmeyi takiben bağışıklık hücresi fonksiyonuna odaklanmaktadır. İnme patolojisinde yerleşik ve infiltre olan bağışıklık hücrelerinin yasalarını anlamayı amaçlıyoruz. Şu anda, akış sitometrisi, nöroinflamasyonlarda bağışıklık hücresi fonksiyonunu ve etkileşimlerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.

Ek olarak, immünon teknikler ve tek hücre ve dizileme, nöro immün etkileşimlerdeki araştırmaları ilerletmektedir. Laboratuvarımız, astrositlerin nöro immün etkileşimlerdeki rotasını, nöroinflamatuar süreçlere anjiyo katkılarını göstermeye odaklanacaktır. Başlamak için 50 mililitrelik bir şırınga alın ve ucuna 26 gauge bir iğne takın.

Şırıngayı tamamen tuzlu su çözeltisiyle doldurun. Anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü bir köpük tahta üzerine yerleştirin. Ön uzuvları ve arka uzuvları uzatın ve 26 gauge iğne kullanarak sabitleyin.

Tırtıklı başparmak forsepsleri kullanarak karın derisini kavrayın ve karaciğeri ortaya çıkarmak için yanal bir kesi yapın. Kalbi ortaya çıkarmak için kaburgaların her iki tarafını da kesin. Şimdi 26 gauge iğneyi sol ventriküle sokun ve sağ kehaneti kesin.

Kanın dışarı akmasını sağlamak için şırınga pistonuna basın. Kahinden akan kan berrak görünene kadar perfüzyona devam edin. Farenin başını kestikten ve beyni çıkardıktan sonra, onu bir fare çeliği beyin matrisine aktarın ve ardışık iki milimetre kalınlığında kornea dilimlerine ayırın.

12 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 500 mikrolitre sindirim enzimi karışımı ekleyin. Mikro forseps kullanarak enfarktüs dokusunu hassas bir şekilde ayırın ve sindirim enzimi karışımına aktarın. Son olarak, dokuyu oftalmik makasla mümkün olan en küçük parçalara ayırın ve plakayı 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.

AP 1000 pipet kullanarak, dokuyu tek tek hücrelere ayırmak için solüsyonu 10 kez hafifçe aspire edin ve dağıtın. Daha sonra çözeltiyi 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Hem 12 oyuklu plakayı hem de hücre süzgecini kalsiyum ve magnezyum içeren buz gibi soğuk HBSS ile tekrar tekrar durulayın.

Şimdi toplanan hücre süspansiyonunu 500 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. Peleti bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.

Santrifüjleme işlemini tekrarladıktan sonra, peleti 150 mikrolitre PBS'de tekrar süspanse edin ve süspansiyonu 96 oyuklu yuvarlak bir taban plakasına aktarın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 G'de tekrar santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, 96 oyuklu plakayı sıkıca kavrayın ve süpernatanı atmak için hızla ters çevirin.

Daha sonra, hücre canlılığı floresan kalıbını PBS'de bir ila yüz oranında seyreltin ve peleti 150 mikrolitre seyreltilmiş boya çözeltisinde yeniden süspanse edin. Plakayı ışıktan korurken oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Dört santigrat derecede beş dakika santrifüjledikten sonra süpernatanı atın.

Hücre yüzeyi antikor kokteylini manyetik aktive hücre sıralamasında veya maksimum tamponda seyreltin ve hücreleri yıkamadan antikor kokteylini kuyucuklara ekleyin. Beş dakika daha santrifüjlemeden önce dört santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe edin. Plakayı santrifüjledikten ve süpernatanı attıktan sonra, peleti 150 mikrolitre maksimum tamponda yeniden süspanse edin.

Süspansiyonu 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine veya beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren test tüplerine aktarın. Manuel yöntemler veya çevrimiçi bir panel tasarım aracı kullanarak cihaz konfigürasyonuna göre çok renkli bir akış sitometri paneli tasarlayın. Canlı olmayan hücreleri ve kalıntıları verilerden hariç tutmak için panele bir hücre canlılığı boyası ekleyin.

İlgilenilen hücrelerin doğru şekilde görüntülendiğinden ve düzgün bir şekilde geçitlenebildiğinden emin olmak için ileri saçılma ve yan saçılma dedektörü ayarlarını yapın. Kalıntıları ve yabancı gürültüyü ortadan kaldırmak için FSC ve SSC parametrelerine ince ayar yapın. FSC alanına karşı yüksekliği gösteren bir nokta grafiğinde, çiftleri tek hücrelerden ayırt edin.

Canlı hücreleri izole etmek için canlılık boyasının negatif sinyalini kullanın. Boyanmamış hücrelerin her parametre için uygun şekilde ölçeklendiğini doğrulamak için boyanmamış hücrelerden alınan otofloresan kontrolünü lekeli hücre pozitif kontrolleriyle karşılaştırın. Çok renkli hücre örneklerini analiz ederek ve iki renkli nokta grafiğini inceleyerek telafide ince ayar yapın.

Hücre popülasyonları birbiriyle dikey veya yatay olarak hizalanana kadar telafi ayarlarını yukarı veya aşağı doğru ayarlayın. Lenfositleri, mikrogliaları, miyeloid hücreleri ve astrositleri spesifik ekspresyon modellerine göre ayırt etmek için CD45 ve CD11B sinyallerini kullanın. Lenfositleri tanımlamak için bir referans olarak hizmet etmek için sahte beyin dokusunu bir otofloresan kontrolü olarak kullanın.

Belirli bir hedefi analiz ediyorsanız, inme sonrası beyin dokusuyla bir FMO kontrolü kullanın. Kontrol verilerini toplayın ve kaydedin. Benzer şekilde, örnek verileri toplayın ve kaydedin.

Hedef hücre popülasyonlarını seçin ve beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren test tüplerine veya 15 mililitrelik konik santrifüj tüplerine ayırın. 500 mikrolitre PBS ekleyin ve hücre canlılığını korumak ve pelet oluşumuna yardımcı olmak için toplama tüpünü durulayın. CCR7 pozitif ve CD11c pozitif mikroglia, iskemik inmeden sonraki ikinci ve yedinci günlerde ölçüldü.

Mikrogliadaki CCR7 ekspresyonu ikinci günde keskin bir şekilde arttı ve sahte kontrollere kıyasla yedinci günde yüksek kaldı. CD11c pozitif mikroglia da benzer bir eğilim izleyerek ikinci günde zirveye ulaştı ve yedinci günde sahteden daha yüksek kaldı. Nokta grafikleri, ikinci ve yedinci günlerde yoğun CCR7 ve CD11c sinyalleri gösterdi.

Sahte kontrollerdeki seyrek sinyallerle kontrast. Bir geçit stratejisi, CD11B ve CD45 ekspresyonunu kullanarak mikroglia miyeloid hücrelerini ve lenfositleri ayırdı. Ek belirteçler, canlı hücreleri, astrositleri ve lenfosit alt kümelerini tanımladı.