Name: Mini İnme Murin Modelinde Nöroimmün Etkileşimlerin İzolasyonu ve Flow Sitometrik Değerlendirmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Öğrenin, mini inme modelinde akış sitometrisi ile nöroimmün etkileşimleri değerlendirmeyi. Bu yöntem, iskemik inme sonrası bağışıklık hücreleri fonksiyonlarını inceleyerek nörodejeneratif hastalıklarda bağışıklık yanıtlarını anlamaya katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Kleindorfer, D. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2021+Guideline+for+the+prevention+of+stroke+in+patients+with+stroke+and+transient+ischemic+attack%3A+A+guideline+from+the+American+heart+association%2FAmerican+Stroke+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">2021 Guideline for the prevention of stroke in patients with stroke and transient ischemic attack: A guideline from the American heart association/American Stroke Association.</a> Stroke. 52 (7), e364-e467 (2021).</li>
<li>Pu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+global+trends+in+ischemic+stroke+incidence%2C+deaths+and+disability-adjusted+life+years+from+2020+to+2030%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Projected global trends in ischemic stroke incidence, deaths and disability-adjusted life years from 2020 to 2030.</a> Stroke. 54 (5), 1330-1339 (2023).</li>
<li>Cheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+the+stroke+burden+at+the+global%2C+regional%2C+and+national+levels+up+to+2050+based+on+the+global+burden+of+disease+study+2021%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Projections of the stroke burden at the global, regional, and national levels up to 2050 based on the global burden of disease study 2021.</a> J Am Heart Assoc. 13 (23), e036142(2024).</li>
<li>Ma, Y., Yang, S., He, Q., Zhang, D., Chang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+immune+cells+in+post-stroke+angiogenesis+and+neuronal+remodeling%3A+The+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">The role of immune cells in post-stroke angiogenesis and neuronal remodeling: The known and the unknown.</a> Front Immunol. 12, 784098(2021).</li>
<li>Duan, M., Xu, Y., Li, Y., Feng, H., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+brain-peripheral+immune+responses+for+secondary+brain+injury+after+ischemic+and+hemorrhagic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Targeting brain-peripheral immune responses for secondary brain injury after ischemic and hemorrhagic stroke.</a> J Neuroinflammation. 21 (1), 102(2024).</li>
<li>Chen, B. R., Wu, T., Chen, T. H., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+interactions+and+their+roles+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Fundam+Res%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune interactions and their roles in neurodegenerative diseases.</a> Fundam Res. 4 (2), 251-261 (2024).</li>
<li>Zhang, Z., Lv, M., Zhou, X., Cui, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+peripheral+immune+cells+in+the+recovery+of+neurological+function+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Roles of peripheral immune cells in the recovery of neurological function after ischemic stroke.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1013905(2022).</li>
<li>Garcia-Bonilla, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+brain+and+blood+single-cell+transcriptomics+in+acute+and+subacute+phases+after+experimental+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Analysis of brain and blood single-cell transcriptomics in acute and subacute phases after experimental stroke.</a> Nat Immunol. 25 (2), 357-370 (2024).</li>
<li>Stevens, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+flow+cytometry+to+evaluate+temporal+changes+in+inflammatory+cells+following+focal+cerebral+ischemia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">The use of flow cytometry to evaluate temporal changes in inflammatory cells following focal cerebral ischemia in mice.</a> Brain Res. 932 (1-2), 110-119 (2002).</li>
<li>Carson, M. J., Reilly, C. R., Sutcliffe, J. G., Lo, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+microglia+resemble+immature+antigen-presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Mature microglia resemble immature antigen-presenting cells.</a> Glia. 22 (1), 72-85 (1998).</li>
<li>Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).</li>
<li>De Haas, A. H., Boddeke, H. W., Biber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li>
<li>Mcdonough, A., Weinstein, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroimmune+response+in+ischemic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Neuroimmune response in ischemic preconditioning.</a> Neurotherapeutics. 13 (4), 748-761 (2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+analysis+reveals+dynamic+microglial-induced+a1+astrocyte+reactivity+via+c3%2Fc3ar%2FNF-kappab+signaling+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Transcriptome analysis reveals dynamic microglial-induced a1 astrocyte reactivity via c3/c3ar/NF-kappab signaling after ischemic stroke.</a> Mol Neurobiol. 61 (12), 10246-10270 (2024).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry. 69A, 1037-1042 (2006).</li>
<li>Siddiqui, S., Livak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+advanced+flow+cytometry%3A+A+practical+guide%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Principles of advanced flow cytometry: A practical guide.</a> Methods Mol Biol. 2580, 89-114 (2023).</li>
<li>Sousa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomics+reveals+distinct+inflammation-induced+microglia+signatures%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomics reveals distinct inflammation-induced microglia signatures.</a> EMBO Rep. 19 (11), e46171(2018).</li>
<li>Martin, E., El-Behi, M., Fontaine, B., Delarasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+microglia+and+monocyte-derived+macrophages+from+the+central+nervous+system+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of microglia and monocyte-derived macrophages from the central nervous system by flow cytometry.</a> J Vis Exp. 124, e55781(2017).</li>
<li>Zhang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia-associated+neuroinflammation+is+a+potential+therapeutic+target+for+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia-associated neuroinflammation is a potential therapeutic target for ischemic stroke.</a> Neural Regen Res. 16 (1), 6-11 (2021).</li>
<li>Mao, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+polarization+in+ischemic+stroke%3A+Complex+mechanisms+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+Med+J+%28Engl%29%22%5BJournal%5D)">Microglia polarization in ischemic stroke: Complex mechanisms and therapeutic interventions.</a> Chin Med J (Engl). 134 (20), 2415-2417 (2021).</li>
<li>Shui, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+ischemic+stroke%3A+Pathogenesis+insights+and+therapeutic+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inflamm+Res%22%5BJournal%5D)">Microglia in ischemic stroke: Pathogenesis insights and therapeutic challenges.</a> J Inflamm Res. 17, 3335-3352 (2024).</li>
<li>Feng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltration+and+persistence+of+lymphocytes+during+late-stage+cerebral+ischemia+in+middle+cerebral+artery+occlusion+and+photothrombotic+stroke+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Infiltration and persistence of lymphocytes during late-stage cerebral ischemia in middle cerebral artery occlusion and photothrombotic stroke models.</a> J Neuroinflammation. 14 (1), 248(2017).</li>
<li>Schulze, J., Gellrich, J., Kirsch, M., Dressel, A., Vogelgesang, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system-infiltrating+t+lymphocytes+in+stroke+are+activated+via+their+TCR+%28T-cell+receptor%29+but+lack+CD25+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Central nervous system-infiltrating t lymphocytes in stroke are activated via their TCR (T-cell receptor) but lack CD25 expression.</a> Stroke. 52 (9), 2939-2947 (2021).</li>
<li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Des+Devel+Ther%22%5BJournal%5D)">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li>
<li>Leelatian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+human+tissues+and+solid+tumors+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+B+Clin+Cytom%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry.</a> Cytometry B Clin Cytom. 92 (1), 68-78 (2017).</li>
<li>Delmonte, O. M., Fleisher, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry%3A+Surface+markers+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry: Surface markers and beyond.</a> J Allergy Clin Immunol. 143 (2), 528-537 (2019).</li>
<li>Schmit, T., Klomp, M., Khan, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+flow+cytometry+for+simultaneous+and+multi-parametric+analysis+of+heterogenous+cell+populations+in+basic+and+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The application of flow cytometry for simultaneous and multi-parametric analysis of heterogenous cell populations in basic and clinical research.</a> Methods Mol Biol. 2223, 183-200 (2021).</li>
<li>Dukhinova, M., Kopeikina, E., Ponomarev, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Usage+of+multiparameter+flow+cytometry+to+study+microglia+and+macrophage+heterogeneity+in+the+central+nervous+system+during+neuroinflammation+and+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Usage of multiparameter flow cytometry to study microglia and macrophage heterogeneity in the central nervous system during neuroinflammation and neurodegeneration.</a> Methods Mol Biol. 1745, 167-177 (2018).</li>
<li>Rui, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid+gasdermin+d+drives+early-stage+T-cell+immunity+and+peripheral+inflammation+in+a+mouse+model+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Myeloid gasdermin d drives early-stage T-cell immunity and peripheral inflammation in a mouse model of Alzheimer's disease.</a> J Neuroinflammation. 21 (1), 266(2024).</li>
<li>Rauber, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+identifies+changes+in+peripheral+and+intrathecal+lymphocyte+patterns+in+CNS+autoimmune+disorders+and+primary+CNS+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry identifies changes in peripheral and intrathecal lymphocyte patterns in CNS autoimmune disorders and primary CNS malignancies.</a> J Neuroinflammation. 21 (1), 286(2024).</li>
<li>Rayaprolu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+microglial+sorting+coupled+with+quantitative+proteomics+identifies+moesin+as+a+highly-abundant+microglial+protein+with+relevance+to+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric microglial sorting coupled with quantitative proteomics identifies moesin as a highly-abundant microglial protein with relevance to Alzheimer's disease.</a> Mol Neurodegener. 15 (1), 28(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1,5 mL Mikrosantrifüj Tüpü</td><td>YUVA&nbsp;</td><td>615601</td><td>Laboratuvar malzemesi</td></tr><tr><td>1&kez; PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>96-kuyucuklu Şeffaf Yuvarlak Tabanlı TC-işlenmiş Mikroplaka</td><td>Corning</td><td>3799</td><td>Laboratuvar malzemesi</td></tr><tr><td>APC fare önleyici CD19</td><td>Biyolojik Efsane</td><td>152410</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>APC/Cyanine7 fare önleyici CD45</td><td>Biyolojik Efsane</td><td>103116</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Avertin (%1,25)</td><td>Nanjing Aibei Biyoteknoloji&nbsp;</td><td>M2920 Serisi</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>BD FACSAria II</td><td>BD</td><td>642510</td><td>Ekipman</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 421 anti-fare CD4</td><td>Biyolojik Efsane</td><td>100437</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>Brilliant Violet 605 anti-fare / insan CD11b</td><td>Biyolojik Efsane</td><td>101237</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1933-1G</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Kollajenaz IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4-28-100MG</td><td>Enzim</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>New England Biyolaboratuvarları</td><td>M0303L Serisi</td><td>Enzim</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS-100G</td><td>Kimyasal</td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test Tüpleri</td><td>Corning</td><td>352052</td><td>Laboratuvar malzemesi</td></tr><tr><td>Şahin&nbsp; 15 mL Konik Santrifüj Tüpleri</td><td>Corning</td><td>352095</td><td>Laboratuvar malzemesi</td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>BD</td><td></td><td>Yazılım</td></tr><tr><td>GLAST (ACSA-1) Antikoru, PE</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-344</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>İzofluran</td><td>RWD Yaşam Bilimleri</td><td>R510-22-10</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 fare önleyici CD3</td><td>Biyolojik Efsane</td><td>100220</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>PE/Dazzle 594 anti-fare NK-1.1</td><td>Biyolojik Efsane</td><td>156518</td><td>Antikor</td></tr><tr><td>TRIzol Reaktifi</td><td>Thermo Fisher Bilimsel A.Ş.</td><td>15596026</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>UltraPure DNase/RNase İçermeyen Damıtılmış Su</td><td>Thermo Fisher Bilimsel A.Ş.</td><td>10977015</td><td>Reaktif</td></tr><tr><td>Vetbond Doku Yapıştırıcıları</td><td>3 milyon</td><td>1469SB</td><td>Laboratuvar malzemesi</td></tr><tr><td>Zombie Aqua Düzeltilebilir Canlılık Kiti</td><td>Biyolojik Efsane</td><td>423102</td><td>Amin reaktif floresan boya</td></tr></tbody></table>

mini İnme murin modelinde nöroimmün etkileşimlerin İzolasyonu ve flow sitometrik değerlendirmesi

Isolation and Flow Cytometric Assessment of Neuroimmune Interactions in a Mini-Stroke Murine Model

Bu çalışmada, iskemik inme sonrası immün hücrelerin işlevselliğini değerlendirmek için mini inme modelinde akış sitometrik analiz kullanan rafine bir protokol sunuyoruz. Mini inme, sağ orta serebral arterin (MCA) distal dalının kalıcı ligasyonu ile indüklendi ve ardından bilateral ortak karotis arterlerin (CCA'lar) 7 dakikalık bir oklüzyonu izledi. Bu metodoloji, küçük, tutarlı lezyon hacimleri ve oldukça düşük mortalite oranı ile karakterize hafif bir inme sağlar. Ayrıca, modelin uzun vadeli nöroimmün etkileşimleri araş...

Mini İnme Murin Modelinde Nöroimmün Etkileşimlerin İzolasyonu ve Flow Sitometrik Değerlendirmesi

Stroke is a leading cause of death and long-term disability worldwide, with ischemic stroke representing the majority of cases. Following an ischemic ...

Araştırmamızın kapsamı, iskemik inmeyi takiben bağışıklık hücresi fonksiyonuna odaklanmaktadır. İnme patolojisinde yerleşik ve infiltre olan bağışıklık hücrelerinin yasalarını anlamayı amaçlıyoruz. Şu anda, akış sitometrisi, nöroinflamasyonlarda bağışıklık hücresi fonksiyonunu ve etkileşimlerini değerlendirmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.Ek olarak, immünon teknikler ve tek hücre ve dizileme, nöro immün etkileşimlerdeki araştırmaları ilerletmektedir. Laboratuvarımız, astrositlerin nöro immün etkileşimlerdeki rotasını, nöroinflamatuar süreçlere anjiyo katkılarını göstermeye odaklanacaktır. Başlamak için 50 mililitrelik bir şırınga alın ve ucuna 26 gauge bir iğne takın.Şırıngayı tamamen tuzlu su çözeltisiyle doldurun. Anestezi uygulanmış fareyi sırtüstü bir köpük tahta üzerine yerleştirin. Ön uzuvları ve arka uzuvları uzatın ve 26 gauge iğne kullanarak sabitleyin.Tırtıklı başparmak forsepsleri kullanarak karın derisini kavrayın ve karaciğeri ortaya çıkarmak için yanal bir kesi yapın. Kalbi ortaya çıkarmak için kaburgaların her iki tarafını da kesin. Şimdi 26 gauge iğneyi sol ventriküle sokun ve sağ kehaneti kesin.Kanın dışarı akmasını sağlamak için şırınga pistonuna basın. Kahinden akan kan berrak görünene kadar perfüzyona devam edin. Farenin başını kestikten ve beyni çıkardıktan sonra, onu bir fare çeliği beyin matrisine aktarın ve ardışık iki milimetre kalınlığında kornea dilimlerine ayırın.12 oyuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna 500 mikrolitre sindirim enzimi karışımı ekleyin. Mikro forseps kullanarak enfarktüs dokusunu hassas bir şekilde ayırın ve sindirim enzimi karışımına aktarın. Son olarak, dokuyu oftalmik makasla mümkün olan en küçük parçalara ayırın ve plakayı 37 santigrat derecede 20 dakika inkübe edin.AP 1000 pipet kullanarak, dokuyu tek tek hücrelere ayırmak için solüsyonu 10 kez hafifçe aspire edin ve dağıtın. Daha sonra çözeltiyi 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden geçirin. Hem 12 oyuklu plakayı hem de hücre süzgecini kalsiyum ve magnezyum içeren buz gibi soğuk HBSS ile tekrar tekrar durulayın.Şimdi toplanan hücre süspansiyonunu 500 G'de dört santigrat derecede beş dakika santrifüjleyin. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice atın. Peleti bir mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.Santrifüjleme işlemini tekrarladıktan sonra, peleti 150 mikrolitre PBS'de tekrar süspanse edin ve süspansiyonu 96 oyuklu yuvarlak bir taban plakasına aktarın. Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 G'de tekrar santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, 96 oyuklu plakayı sıkıca kavrayın ve süpernatanı atmak için hızla ters çevirin.Daha sonra, hücre canlılığı floresan kalıbını PBS'de bir ila yüz oranında seyreltin ve peleti 150 mikrolitre seyreltilmiş boya çözeltisinde yeniden süspanse edin. Plakayı ışıktan korurken oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Dört santigrat derecede beş dakika santrifüjledikten sonra süpernatanı atın.Hücre yüzeyi antikor kokteylini manyetik aktive hücre sıralamasında veya maksimum tamponda seyreltin ve hücreleri yıkamadan antikor kokteylini kuyucuklara ekleyin. Beş dakika daha santrifüjlemeden önce dört santigrat derecede 15 ila 20 dakika inkübe edin. Plakayı santrifüjledikten ve süpernatanı attıktan sonra, peleti 150 mikrolitre maksimum tamponda yeniden süspanse edin.Süspansiyonu 1,5 mililitrelik santrifüj tüplerine veya beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren test tüplerine aktarın. Manuel yöntemler veya çevrimiçi bir panel tasarım aracı kullanarak cihaz konfigürasyonuna göre çok renkli bir akış sitometri paneli tasarlayın. Canlı olmayan hücreleri ve kalıntıları verilerden hariç tutmak için panele bir hücre canlılığı boyası ekleyin.İlgilenilen hücrelerin doğru şekilde görüntülendiğinden ve düzgün bir şekilde geçitlenebildiğinden emin olmak için ileri saçılma ve yan saçılma dedektörü ayarlarını yapın. Kalıntıları ve yabancı gürültüyü ortadan kaldırmak için FSC ve SSC parametrelerine ince ayar yapın. FSC alanına karşı yüksekliği gösteren bir nokta grafiğinde, çiftleri tek hücrelerden ayırt edin.Canlı hücreleri izole etmek için canlılık boyasının negatif sinyalini kullanın. Boyanmamış hücrelerin her parametre için uygun şekilde ölçeklendiğini doğrulamak için boyanmamış hücrelerden alınan otofloresan kontrolünü lekeli hücre pozitif kontrolleriyle karşılaştırın. Çok renkli hücre örneklerini analiz ederek ve iki renkli nokta grafiğini inceleyerek telafide ince ayar yapın.Hücre popülasyonları birbiriyle dikey veya yatay olarak hizalanana kadar telafi ayarlarını yukarı veya aşağı doğru ayarlayın. Lenfositleri, mikrogliaları, miyeloid hücreleri ve astrositleri spesifik ekspresyon modellerine göre ayırt etmek için CD45 ve CD11B sinyallerini kullanın. Lenfositleri tanımlamak için bir referans olarak hizmet etmek için sahte beyin dokusunu bir otofloresan kontrolü olarak kullanın.Belirli bir hedefi analiz ediyorsanız, inme sonrası beyin dokusuyla bir FMO kontrolü kullanın. Kontrol verilerini toplayın ve kaydedin. Benzer şekilde, örnek verileri toplayın ve kaydedin.Hedef hücre popülasyonlarını seçin ve beş mililitrelik yuvarlak tabanlı polistiren test tüplerine veya 15 mililitrelik konik santrifüj tüplerine ayırın. 500 mikrolitre PBS ekleyin ve hücre canlılığını korumak ve pelet oluşumuna yardımcı olmak için toplama tüpünü durulayın. CCR7 pozitif ve CD11c pozitif mikroglia, iskemik inmeden sonraki ikinci ve yedinci günlerde ölçüldü.Mikrogliadaki CCR7 ekspresyonu ikinci günde keskin bir şekilde arttı ve sahte kontrollere kıyasla yedinci günde yüksek kaldı. CD11c pozitif mikroglia da benzer bir eğilim izleyerek ikinci günde zirveye ulaştı ve yedinci günde sahteden daha yüksek kaldı. Nokta grafikleri, ikinci ve yedinci günlerde yoğun CCR7 ve CD11c sinyalleri gösterdi.Sahte kontrollerdeki seyrek sinyallerle kontrast. Bir geçit stratejisi, CD11B ve CD45 ekspresyonunu kullanarak mikroglia miyeloid hücrelerini ve lenfositleri ayırdı. Ek belirteçler, canlı hücreleri, astrositleri ve lenfosit alt kümelerini tanımladı.

isolation-flow-cytometric-assessment-neuroimmune-interactions-mini

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

İpliksi Orta serebral arter oklüzyonu farelerde iskemik inme eğitimi için ortak bir model.

Fare Modelleme İnme - Filament Model Orta Serebral Arter Tıkanıklığı

Orta serebral arter oklüzyonu (MCAO) çeşitli kemirgen modelleri yaygın deneysel beyin araştırmalarda kullanılır. Burada, insan iskemik strok çoğunluğu tarafından uygulanan zarar tekabül eden bir boyutta tutarlı bir kortikal enfarktüs üreten transkraniyal sürekli uzak MCAO modelini göstermektedir.

Farelerde Modelleme İnme: Distal Orta Serebral Arter Daimi Pıhtılaşma

Inme sonrası beyin miyeloid hücreler karakterizasyonu optik parçalama yöntemi kullanılarak stereolojinin tarafından gerçekleştirilen, ya da beynin bir akım sitometri ile süspansiyonları lökosit olabilir. Her ikisi de iskemik beyin bulundu ana miyeloid hücre alt doğru fenotipik ayrımı gerçekleştirmek için yararlı teknikler vardır.

Geçici veya kalıcı Serebral İskemi Modelinde lökosit alt popülasyonlarının Stereolojik ve Sitometrisi Karakterizasyonu

Bu protokol, farelerde geçici orta serebral arter tıkanıklığını takiben enfarktüs hacimlerini ve kan-beyin bariyeri bozulmasını azaltan tekrarlayan hipoksik ön koşullandırmayı veya sistemik hipoksiye kısa süreli maruziyetleri tanımlar. Ayrıca, nörovasküler korumanın etkinliğini değerlendirmek için inme sonrası enfarktüs hacminin ve kan-beyin bariyeri bozulmasının ikili miktar tayinini detaylandırır.

Farelerde Tekrarlanan Hipoksik Önkoşullanma ve Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ardından Nörovasküler Koruma Kantitasyonu

Burada, geri dönüşümsüz bir endotelyal nitrik oksit sentaz (eNOS) inhibitörünün (L-Nio) lokal enjeksiyonu ile murin beyaz cevherinde fokal inme üretimi için metodoloji sunuyoruz. Bu tekniğin potansiyel uygulamalarını genişleten iki stereotaktik varyasyon, retrograd nöronal izleme ve taze doku etiketleme ve diseksiyon sunulmaktadır.

Aksonal Dejenerasyon ve Beyaz Cevher Nörobiyoloji Çalışması Çok Yönlü Fare Modeli subkortikal beyaz madde İnme

İnflamasyon, iskemik inme patogenezinde merkezi bir rol oynar. Artan kanıtlar, erken beyin hasarını şiddetlendiren iki ucu keskin bir kılıç gibi davrandığını, ancak aynı zamanda daha sonraki onarıma da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu protokol, immün hücrelerin iskemik beyinden izolasyonunu ve müteakip akış sitometrik fenotiplemesini tanımlar.

İskemik Fare Beyin gelen Bağışıklık Hücreleri İzolasyon ve Akım Sitometrisi Analizi

inme patofizyolojisini anlamak için, güvenilir modeller kullanmak önemlidir. Farelerde en sık kullanılan inme modellerinden birini anlatacağız Bu yazıda, orta serebral arter tıkanıklığı (MCAO) modeli olarak adlandırılan reperfüzyon ile (ayrıca lümen içi filament veya sütür modeli olarak adlandırılır).

Farelerde Orta Serebral Arter Tıkanıklığı ve Reperfüzyon Kaynaklı İnme Cerrahi Yaklaşım

Bu protokol, iskemik inmenin bir murin modeli olan geçici orta serebral arter tıkanıklığını takiben pulmoner ortamda immün hücre kompozisyonu, sitokin profili ve kemokin profilindeki değişiklikleri tanımlamak için flow sitometrinin kullanımını açıklamaktadır.

Pulmoner Ortamda İmmün Hücrelerin ve Proinflamatuar Mediatörlerin Karakterizasyonu

Deneysel inme araştırmalarında orta serebral arter tıkanma (MCAo) farklı modelleri kullanılmaktadır. Burada, serebrovasküler trombüsin spontan pıhtı lizisi veya tedavisi nedeniyle çıkarıldığı insan inmesini taklit etmeyi amaçlayan dış karotis arter (ECA) yoluyla geçici MCAo'nun deneysel bir inme modeli tanımlanmıştır.

Farelerde Modelleme İnme: Dış Karotid Arter yoluyla Geçici Orta Serebral Arter Tıkanıklığı

Beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için yaygın bir yaklaşım, bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmektir. Burada, murin beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ve etkili protokol sağlanmıştır.

Fare Beyninden ve Kafatasından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi

Öğrenin, mini inme modelinde akış sitometrisi ile nöroimmün etkileşimleri değerlendirmeyi. Bu yöntem, iskemik inme sonrası bağışıklık hücreleri fonksiyonlarını inceleyerek nörodejeneratif hastalıklarda bağışıklık yanıtlarını anlamaya katkı sağlar.

Mini İnme Murin Modelinde Nöroimmün Etkileşimlerin İzolasyonu ve Flow Sitometrik Değerlendirmesi

Daha fazla video keşfet