Memeli Hücrelerinde Godanti Bhasma Tarafından Tetiklenen Fagositozun Sıralı Hücresel Olaylarının Araştırılması

Bir fagositin yabancı parçacıkları yuttuğu ve parçaladığı fagositoz. Bağışıklık savunması için çok önemlidir. Bu karmaşık hücresel süreci verimli bir şekilde izlemek ve değerlendirmek için geliştirilmiş kullanıcı dostu yöntemlere ihtiyaç vardır.

Gerçek zamanlı bozunma olaylarını yakalamak ve foto ağartmadan kaynaklanan artefaktlardan kaçınmak, fagositoz ve hücre içi kaçakçılığın doğru bir şekilde incelenmesinde temel zorluklar olmaya devam etmektedir. Floresan veya sentetik partikülden farklı olarak protokolümüz, foto ağartma, optimizasyon veya karmaşık hazırlık olmadan fagositoz aşamalarının doğrudan görselleştirilmesini sağlayan etiketsiz bir parçacık olan Godanti Bhasma'yı kullanır. Bu bulgular, fagositik mekanizmaları incelemek için tekrarlanabilir bir model sağlayarak veziküler dinamikleri, patojen disfonksiyonunu ve immün ve lizozomal bozukluklara potansiyel terapötik müdahaleyi incelemek için yeni araçlar sunar.

Olgunlaşma fagozomunun moleküler düzenleyicilerini araştırmayı, hastalık modellerinde fagositik disfonksiyonu araştırmayı ve veziküler dinamikleri ve hücre içi kaçakçılığı modüle eden potansiyel ilaçları taramayı amaçlıyoruz. Başlamak için tam olarak 100 miligram Godanti Bhasma veya GB tozu tartın. Tozu, %10 FBS ve %1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş 10 mililitre DMEM içinde süspanse edin.

İçeriği karıştırmak için süspansiyonu iyice vorteksleyin ve daha büyük parçacıkların dibe çökmesini sağlamak için karışımı bir dakika bekletin. Bir pipet kullanarak süspansiyonun üst beş mililitresini steril bir santrifüj tüpüne aktarın. Beş mililitre transfer edilen GB süspansiyonunu, daha fazla hücre kültürü çalışması için stok çözeltisi olarak etiketleyin.

Hücrelere eklemeden önce parçacıkların eşit dağılımını sağlamak için süspansiyonu tekrar iyice vorteksleyin. 3 10'dan dördüncü kuvvete kadar 3T3-L1 hücrelerini iki mililitre DMEM içeren 35 milimetrelik bir kaba tohumlayın. Hücreler %70 birleşene kadar çanağı 37 santigrat derecede% 5 karbondioksitli bir atmosferde inkübe edin.

Daha sonra 300 mikrolitre GB stok süspansiyonunu iki mililitre önceden ısıtılmış taze kültür ortamına iyice karıştırın. Hücreleri ve GB süspansiyonunu içeren kültür kabını görüntüleme mikroskobunun sahne inkübatörüne yerleştirin. Mikroskopta 10x objektifi seçin.

Parlak düğmesini kullanarak parlak alan aydınlatmasını açın. Ardından DIGI ImagePlus yazılımını başlatın ve uygun kamerayı seçin. Tıkla Yakala düğmesine basın ve hızlandırılmış çekim seçeneğini seçin.

Aralık süresini beş dakikaya ayarlayın ve Bitir düğmesine tıklayarak kayda başlayın. Mikroskop aşaması karbondioksit inkübatöründe 16 ila 24 saat boyunca sürekli olarak beş dakikalık aralıklarla parlak alan görüntüleri yakalayın. Yakalanan tüm görüntüleri hızlandırılmış bir videoda derlemek için ImageJ yazılımını kullanın.

Bu, partikül içselleştirmesinden tam bozunmalarına kadar fagositoz aşamalarının tanımlanmasını sağlar. 96 oyuklu plakalarda 24 saatlik hücre büyümesinden sonra, GB partikül stok süspansiyonunu iyice karıştırın. Her kuyucuğa 30 mikrolitre süspansiyon ekleyin.

Negatif kontroller olarak GB parçacıkları olmayan kuyucuklar kullanın. Vakuol oluşumunu indüklemek için plakaları 37 santigrat derecede %5 karbondioksit içinde 24 saat inkübe edin. Nötr kırmızı çözelti hazırlamak için, serum içermeyen DMEM'de mililitre başına 0,5 miligram çözelti yapmak üzere nötr kırmızıyı çözün.

Çözeltiyi 0,2 mikrometrelik bir filtreden geçirin. Görüntüleme için medyayı 96 oyuklu plakalardan çıkarın. Her bir oyuğa 60 mikrolitre filtre boyası ekledikten sonra, plakayı 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin.

Fazla boyayı çıkarmak için kuyucukları PBS ile üç kez yıkayın. Ardından mikroskobik görüntüleme ile devam edin. Vakuollerin boyutunu, morfolojisini ve sayısını değerlendirmek için 20x objektifi kullanarak lekeli vakuolleri mikroskop altında inceleyin.

Bafilomisin A1 stok çözeltisini hazırlamak için, 100 mikrogram bileşiği 50 mikrolitre dimetil sülfoksit içinde çözün. Daha sonra 950 mikrolitre DMEM ile seyreltin. Çalışma çözeltisi için, 0,1 nanomolar nihai konsantrasyon elde etmek için stoğun bir mikrolitresini 1,6 mililitre DMEM içinde seyreltin.

Çalışma solüsyonunu iyice karıştırın ve 96 oyuklu plakadaki hücreleri içeren kuyucuklara 100 mikrolitre ekleyin. Daha sonra, vakuol ve fagozom oluşumunun inhibisyonunu incelemek için her bir oyuktaki hücreleri 30 mikrolitre GB partikül süspansiyonu ile inkübe edin. Fagozom asitleşmesini inhibe etmek için, daha önce GB ile muamele edilmiş önceden oluşturulmuş vakuollere sahip kuyucuklara 100 mikrolitre bafilomisin A1 çalışma solüsyonu ekleyin. Tüm kuyucukları 37 santigrat derecede %5 karbondioksit içinde 24 saat inkübe edin.

Her kuyucuğa 60 mikrolitre nötr kırmızı boya ekleyin. 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin ve fazla boyayı çıkarmak için kuyucukları üç kez PBS ile yıkayın, ardından mikroskop altında vakuol oluşumunu ve asitleşmeyi analiz edin. Kültürlenmiş hücrelere 50 mikrolitre GB süspansiyonu uygulayın ve standart deney koşulları altında gece boyunca 37 santigrat derecede %5 karbondioksit içinde inkübe edin.

Tedaviyi takiben, hücrelere mililitre başına bir miligram konsantrasyonda akridin portakal çözeltisi ekleyin ve vakuolleri ve asidik veziküler organelleri boyamak için 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Ardından, bağlanmamış boyayı çıkarmak ve arka plan floresansını azaltmak için hücreleri steril PBS ile üç kez yıkayın. Son olarak, 20x objektif ve 450 ila 492 nanometre mavi uyarma filtresi aralığı ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanarak lekeli slaytları hemen analiz edin.

Vakuolar dinamikleri anlamak için hücresel morfolojiyi ve akridin portakal alımını değerlendirin. 30 dakikalık GB işleminden sonra, üç 3T3-L1 hücresinin yüzeyine yapışmış parçacıklar gözlendi. Parçacığın etrafında, parçacık yutulmasının başladığını gösteren fincan benzeri bir zar uzantısı belirdi.

Tedaviden 12 saat sonra, hücrelerin içinde GB partikülleri içeren büyük zara bağlı vakuoller gözlendi. Hızlandırılmış görüntüleme, 4.75 saat boyunca tek bir canlı hücrede kademeli içselleştirme ve vakuol oluşumunu gösterdi. Vakuoller içindeki GB parçacıkları zamanla aşamalı olarak bozuldu ve hücre, vakuolar dönüşümün gösterdiği gibi normal morfolojiye kavuştu.

Akış sitometrisi analizi, içselleştirilmiş Godanti Bhasma partiküllerinin 24 saat içinde tamamen bozunduğunu ve kültür ortamında hiçbir partikül kalmadığını gösterdi. Nötr kırmızı boyama, yalnızca zayıf lizozomal boyama sergileyen kontrollere kıyasla, her üç hücre hattının GB ile tedavi edilen hücrelerinde önemli ölçüde daha yüksek vakuol asitlenmesi ortaya çıkardı. Akridin turuncu boyama, GB 3T3-L1 hücrelerinin vakuollerinde asitleşmeyi gösteren turuncu kırmızı floresan gösterirken, tedavi edilmeyen hücreler sadece yeşil floresan gösterdi.

Bafilomisin ile birlikte tedavi, hem 3T3-L1 hem de HeLa hücrelerinde vakuol oluşumunu inhibe etti, çünkü ilgili kontrollere kıyasla vakuollerin yokluğu ile kanıtlandı. Bafilomisin ile tedaviden sonra, nötr kırmızı alımı etkili bir şekilde bloke edildi ve hücrelerde vakuol asitlenmesini ve olgunlaşmasını bozdu.