Nehir kenarı ve su böcekleri arasında moleküler operasyonel taksonomik birimler (MOTU'lar) oluşturmak için bir karışım boru hattı

MEGA çeşitli tropik bölgelerde tür keşfini hızlandırmayı amaçlayan bu protokol, bilgisayar tabanlı analizlerin bir karışımını kullanarak suda yaşayan ve nehir kıyısındaki böceklerde tür kümeleme hipotezi oluşturmayı amaçlamaktadır.

COI DNA dizisini kullanan bu karışım boru hattı, daha önce yalnızca morfolojik veriler kullanılarak dikilen Anisostena cinsinden rafting böceği için bir tür sınırlaması için daha fazla kanıta yol açmıştır.

Bu protokol, böcek sistematiğinde altın standart olarak kabul edilen morfolojiye dayalı taksonomi yoluyla tür keşfinin, yeterince çalışılmamış, ancak MEGA çeşitli ve oldukça göze çarpmayan su böcekleri için genellikle zaman alıcı ve kafa karıştırıcı olduğu taksonomik engeli ele almayı amaçlamaktadır.

[Emmanuel] Bu boru hattı, dizinin referans verilen diziler başına bilinen türlere karşılık gelip gelmediğine veya türlerin keşfedilmemiş veya tanımlanmamış olup olmadığına bakılmaksızın, MOTU adı verilen moleküler aksesuar hipotezleri üretir.

Bununla, yüzlerce böceğin genital yapısını bir kerede incelemek ve karşılaştırmak yerine, boru hattı, örneklerin türdeşlik açısından incelenebileceği ön kümeleme sağlar.

[Anlatıcı] Başlamak için MEGA X'i başlatın ve hizalama için DNA dizilerini yükleyin. Bir çizgi seçerek, ardından hizalamayı düzenle veya oluştur'a tıklayarak ve yeni bir hizalama oluştur'u seçerek hizalama arayüzünü açın. Seçimi onaylamak için Tamam'a tıklayın ve veri türü olarak DNA'yı seçin. Fareyi düzenleme sekmesinin üzerine getirin. Dosyadan sıra ekle'ye tıklayın. Uygun dizine gidin ve MEGA'ya yüklenecek sıra dosyalarını seçin. Şimdi, hizalamaya tıklayın, ardından dizileri varsayılan ayarları kullanarak hizalamak için ClustalW ile hizala'yı seçin ve devam etmek için tamam'a tıklayın. Dizilerin manuel olarak düzenlenmesi için, eklenen tabanlara veya konumlara tıklayarak ve klavyedeki sil tuşuna basarak tüm eklemeleri silin. Ardından, eksik bir tabanı temsil eden kısa çizgiye tıklayarak, onu kaldırarak ve amaçlanan tabanı yazarak silme işlemlerini düzeltin. Ardından, tüm dizilerin bir karakter içerdiği en erken konumu bulun. Bu konumun hemen solundaki satır başlığındaki boş kutuya tıklayın ve tüm fazla başlangıç konumlarını seçmek için sürükleyin. Bunları kırpmak için sil tuşuna basın. Ardından, son hizalanan konumu bulun ve bu noktanın sağındaki kutuya tıklayın. Sonu kırpmak için tekrar sil tuşuna basın. Şimdi, tüm dizileri seçin ve çevrilmiş protein dizileri sekmesine tıklayın. İstendiğinde, genetik kodu omurgasız mitokondriyal olarak doğrulayın. Genetik kod farklıysa, hayır'a tıklayın ve omurgasız mitokondriyal genetik kod kutusunu işaretlemeye izin veren bir menü görünecektir. Hizalamada yıldız işaretiyle işaretlenmiş durdurma kodonları tüm sütunda görünüyorsa, DNA dizilerine tıklayın ve tüm diziler için ilk konumu silin. Yine, DNA dizilerine tıklayın, ardından hizalamayı .mos veya .mosx formatında kaydedin. TaxonDNA modülünü kullanarak sınırlandırmayı başlatmak için TaxonDNA yazılımını açın. İçe aktar'a tıklayın, ardından FASTA'yı seçin ve hizalama dosyasını FASTA formatında yükleyin. Şimdi modüllere tıklayın, ardından kümeyi seçin. Eşik değerini %3 olarak ayarlayın ve her kümede ayrı bilgi oluştur etiketli kutuyu işaretleyin. Kümelemeyi başlatmak ve ekran görüntüsü alarak sonuçları kaydetmek için şimdi küme oluştur'a tıklayın. Kimura 2-Parametre yöntemini kullanarak sınırlama için MEGA'yı açın ve dosyaya tıklayın, ardından bir dosya veya oturum aç'ı seçin. Mesafeye tıklayın. İkili mesafeleri hesapla'yı seçin ve sınırlama için .meg dosyasını onaylayın. Model veya yöntemin yanındaki kutunun üzerine gelin ve açılan menüyü genişletmek için oka tıklayın. Kimura 2-Parametre modelini seçin ve programı çalıştırmak için tamam'a tıklayın. Sonuçları görüntülemek için veri çıkışı penceresini açın. Dosyaya tıklayın, ardından sonucu kaydetmek için dışa aktarma ve yazdırma mesafelerini seçin. Birleştirme türlerini otomatik bölümleme veya ASAP web sunucusu ile açın. Bir dosya seç etiketli turuncu kutuya tıklayın ve .fasta dosyasını yükleyin. Aşağı kaydırın ve git'i tıklayın. Kümeleme sonucunu indirmek için, en düşük ASAP puanına ve en yüksek P değeri sıralamasına sahip satır için listeye tıklayın. Ardından, ağaç tahminini başlatmak için MEGA'yı açın ve verilere tıklayın. Ardından .meg dosyasını yüklemek için bir dosya veya oturum aç'ı seçin. Modellere tıklayın, ardından en uygun ikame modelini belirlemek için en iyi DNA ve protein modellerini veya ml'yi bul'u seçin. Analiz tercihleri menüsünde tamam'ı tıklayın. Şimdi, ağacı oluşturmak için filogeniye tıklayın, ardından maksimum olabilirlik ağacını oluştur ve test et'i seçin. Model veya yöntemin yanındaki kutuya tıklayarak ve açılır menüden uygun modeli seçerek en uygun ikame modelini kullanın. Filogeni testi altında, filogeni testinin yanındaki kutuya tıklayın, ardından açılır menüden önyükleme yöntemini seçin. Önyükleme çoğaltma sayısının yanındaki kutuya tıklayın. 1.000 yazın ve analizi çalıştırmak için tamam'a tıklayın. Ortaya çıkan ağacı içeren pencere açıldığında, oturumu .mts veya .mtsx dosyası olarak kaydedin. Ayrıca çıktıyı bir .newick dosyası olarak kaydedin ve ağacı .png bir görüntü olarak dışa aktarın. PTP tabanlı sınırlama için PTP web sunucusunu ziyaret edin. Dosya seç'e tıklayın ve ağacı Newick formatında yükleyin. Ağacımın altında köklü'yü seçin. Dış grup takson adları altındaki kutuya, Takson ucunun adını yazarak dış grubu girin. Ardından, maksimum olabilirlik çözümü altında, PTP ML çıktısını kaydetmek için sınırlama sonuçlarını indir'e tıklayın. Benzer şekilde, desteklenen en yüksek bayes çözümü altında, PTP BI çıktısını kaydetmek için sınırlama sonuçlarını indir'e tıklayın. MPTP'nin MPTP tabanlı sınırlaması için MPTP web sunucusunu ziyaret edin. Newick dosyasını gri kareye sürükleyerek veya kareye tıklayarak yükleyin. Veriler yüklendikten sonra, dış grup seçimine devam et'e tıklayın. Dış grup spesifikasyonu sayfasında, dış grup örneklerinin takson etiketlerinin yanındaki onay kutusuna tıklayarak dış grubu seçin. Ardından, model seçimine tıklayın, MPTP'yi seçin ve görselleştirme seçeneklerine tıklayın. Görselleştirme seçenekleri sayfasında, varsayılan ayarları kabul edin. Gönder'e tıklayın. İndirilebilir dosyalar altındaki dosyalara sağ tıklayın ve sonuçları kaydetmek için farklı kaydet'i seçin. Şimdi moleküler operasyonel taksonomik birimleri veya MOTU'yu oluşturmak için, bir fotoğraf düzenleme programı veya PowerPoint kullanarak ağacı açın. Her moleküler tür sınırlama yaklaşımının sonuçlarını temsil etmek için bir çubuk oluşturun. Tüm yaklaşımlar belirli bir moleküler küme için aynı sonuçları verirse, kümeyi fikir birliği ile bir MOTU olarak belirleyin. Bu şekil, COI 3-asal dizilerine ve altı sınırlama yöntemine dayalı olarak boranus böcekleri için maksimum olasılık gen ağacı ve moleküler kümeleme sonuçlarını sunar. Tüm yöntemler, yöntemler arasında aynı kümeleme ile tutarlı bir şekilde dört MOTUS, Byrrhinus negrosensis, Byrrhinus villarini Byrrhinus A ve Byrrhinus B'yi tanımladı. Byrrhinus negrosensis ve Byrrhinus villarini, aynı yerlerden gelmelerine rağmen açıkça ayrılmışlardır. Dört ilden gelen diziler, güçlü bir coğrafi yapılanma göstermeyen Byrrhinus A olarak gruplandırıldı. Bu şekil, Anisostena böceklerinin, yöntemler arasında tam bir anlaşma ile Anisostena angatbuhay, Anisostena auxilium, Anisostena A ve Anisostena B dahil olmak üzere dört MOTUS'ta kümelenmesini göstermektedir. Anisostena auxilium, coğrafi olarak Anisostena A ve Anisostena B ile örtüştü, bu da coğrafyanın tek başına moleküler farklılığı açıklamadığını gösteriyor.