In vivo (İn canlı) Anestezi Uygulanmamış Drosophila Yetişkin Sineklerde Nöral Aktivitenin Görüntülenmesi

Beynin bilişsel esnekliği korumak için anıları nasıl aktif olarak sildiğini veya bastırdığını ortaya çıkarmayı amaçlayarak, doğal hafıza unutmanın moleküler, hücresel ve devre temelini anlamaya çalışıyoruz. Son zamanlarda yapılan araştırmalar, unutmanın sadece anıların pasif bir çürümesi olmadığını, daha ziyade belirli nöronal aktivite kalıpları gerektiren yüksek düzeyde düzenlenmiş aktif bir biyolojik süreç olduğunu göstermiştir.

En büyük zorluk, konektomik, genetik ve davranışsal verileri titiz ve yorumlanabilir bir şekilde entegre ederken belirli devre manipülasyonlarını dinamik bellek süreçlerine bağlamaktır. Unutmanın aktif bir biyolojik olarak düzenlenmiş süreç olduğunu belirlemeye yardımcı olduk. Çalışmamız, Drosophila beyninde normal unutma için gerekli olan spesifik dopaminerjik nöronları ve moleküler yolları tanımladı. Protokolümüz, anestezi olmadan sineklerde fonksiyonel görüntülemeye olanak tanıyarak anesteziklerin istenmeyen nonspesifik etkilerini önler. Bu yaklaşımı, hafıza oluşumu ve aktif hafıza unutmanın altında yatan nöral korelasyonları araştırmak için kullanıyoruz.

[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, 22 gauge hipodermik metal boruyu yaklaşık 10 santimetre uzunluğunda kesmek için Dremel aletleri ve elmas testere bıçağı kullanın. Dremel 420 kesme diski ile, sineğin hortumunu barındırabilecek pürüzsüz ve temiz bir açıklık oluşturmak için borunun her iki ucunu da parlatın. İstenilen kavisli şekli oluşturmak için kesilen boruyu 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünün etrafına sarın. Ardından 7 santimetre uzunluğunda 12 gauge hipodermik metal boru parçasını kesin. Şimdi 2 mikrolitrelik pipet ucunun ucunu 22 gauge metal boruya uyacak şekilde kesmek için bir tıraş bıçağı kullanın. 12 gauge hortumu pipet ucunun diğer ucuna takın. Daha sonra, az miktarda epoksi reçine ve sertleştiriciyi karıştırın. Epoksiyi, küçük metal borunun pipet ucuyla buluştuğu ve daha büyük borunun diğer uca bağlandığı bağlantı noktalarına uygulayın. Düzeneği bir mikro manipülatör tutucusuna bağlamadan ve açıyı gerektiği gibi ayarlamadan önce epoksinin gece boyunca tamamen kürlenmesine izin verin. Şok ve koku veren bir pipet oluşturmak için, bir Dremel elmas aleti kullanarak 1 x 100 cam pipetten 3 mililitre işaretinden 1 mililitre kesin. Daha sonra 1/8 inç kalınlığında 24,5 milimetre x 8 milimetre ölçülerinde küçük bir dikdörtgen akrilik levha kesin. Dikdörtgen akrilik parçaya sığacak şekilde bakır bir şok ızgarası kesin. Bakır ızgaranın zıt uçlarına iki elektrik kablosu lehimleyin. Şimdi bakır ızgarayı akrilik parçanın üzerine yerleştirin ve sineğin karnını ve bacaklarını yerleştirmek için hafifçe bükün. Bakır ızgarayı akrilik parçaya tutturmak için elektrik bandı kullanın. Ardından, cam pipeti şok ızgarasına takmak için sıcak tutkal tabancası kullanın, düz ve ortalanmış olduğundan emin olun. Kayıt odasını oluşturmak için, oda tabanı olarak bir cam mikroskop lamı alın. Reçine ve epoksi yapıştırıcıyı birlikte karıştırın. Epoksi yapıştırıcıyı kullanarak, neodimyum mıknatısları siyah akrilik bir odanın dört köşesine de yapıştırın. Her yapıştırılmış mıknatısın üzerine ek bir mıknatıs yerleştirin. Daha sonra yeni yerleştirilen mıknatısları epoksi kullanarak bir cam slayta yapıştırın. Kürleme sırasında düzeneği ataçlarla yerinde tutun. 200 mikrolitrelik pipet ucunu aspiratörden çıkarın. Aspiratörü Drosophila içeren bir şişeye yerleştirin ve 1.000 mikrolitrelik pipet ucuna tek bir sinek aspire edin. 200 mikrolitrelik pipet ucunu tekrar aspiratöre takın. Ardından aspiratörü hafifçe üfleyin ve hafifçe vurun, böylece sinek 200 mikrolitrelik pipet ucunun üst kısmında kafa üstü hareketsiz hale gelir. Ardından, diseksiyon odasını manipülatör tutucusuna yerleştirin. Vakumu sinek tutma borusuna bağlayın ve akış hızını dakikada yaklaşık 500 mililitreye ayarlayın. Şimdi vakumlu metal boruyu mikroskobun görüş alanının merkezine getirin. Sinek hortumunu vakum tutucuya nazikçe aspire edin. Sineğin kafasını hazne açıklığı ile hizalamak için manipülatörü ayarlayın. Doğru akım güç kaynağını açın. Platin direnç teli kullanarak, gözleri ve göğüs kafesini hazneye yapıştırmak için erimiş miristik asit uygulayın. Sabitlendikten sonra vakum hortumunun bağlantısını kesin. Manipülatörü kullanarak kayıt odasını vakum bağlantısından çıkarın ve odayı ters çevirin. Daha sonra platin rezistans kullanarak hortumu aşağıdan yapıştırın. Her şey yapıştırıldığında, doğru akım güç kaynağını kapatın. Ardından odayı dik konuma getirin. Hazneyi cam sürgülü tabana takın. Makasla küçük bir bant parçası kesin ve sineğin başının önüne ve arkasına yerleştirin. Hazneyi, sineğin başı deneyciye 90 derecelik bir açıyla bakacak şekilde döndürün. Bir diseksiyon iğnesi ile gözlerin kenarları boyunca dikey kesiler yapın. Hazneyi yatay olarak döndürün. Ardından kütikül boyunca yatay bir kesim yapın. Şimdi sineğin kafasının üstüne 100 mikrolitre salin ekleyin. Keskin forseps kullanarak kütikül penceresini çıkarın, ardından forseps ile kalan yağ veya soluk borusunu çıkarın. Hazırlanmış bir sineği bir lazer ve suya daldırma objektifi ile donatılmış bir konfokal mikroskobun mikroskop aşamasına yerleştirin. Bir mikro manipülatör ile, şok ızgarasının ve koku pipetinin konumunu, sineğin şok ızgarası üzerinde doğru şekilde konumlandırılması için ayarlayın. Beynin z eksenini taramak ve ilgilenilen beyin bölgesini bulmak için rota z ayar düğmesini kullanın. Çerçeve boyutunu 512 x 512 piksel olarak ayarlayın. Özel yapım veya ticari olarak temin edilebilen bir koku dağıtım sistemi kullanarak ilgilenilen nörondan kayıt yapmaya başlayın. Kayıt süresini 2 dakika olarak ayarlayın. Eğitim öncesi yanıtları topladıktan 5 dakika sonra koku dağıtım sistemini kullanarak eğitim protokolünü başlatın. Ardından, egzersizden yaklaşık 5-15 dakika sonra egzersiz sonrası yanıtları kaydedin. Kalsiyum indikatörü GCaMP6f ve kırmızı floresan proteini tdTomato, mantar gövdesinin gama ve alfa çizgi loblarına çıkıntı yapan dendritlerle mantar gövdesi çıktı nöronunda seçici olarak eksprese edildi ve nöron, MB077C bölünmüş-GAL4 sürücü hattı kullanılarak görselleştirildi. Mantar gövdesi çıkış nöronundaki 3-oktanol'e kalsiyum yanıtları, anestezi olmadan geri dönüşümlü koşullandırmadan 5 dakika sonra önemli ölçüde azaldı ve 15 dakikada baskılanmış kaldı. Buna karşılık, 4-metilsikloheksanole kalsiyum yanıtları, antrenmandan 5 dakika sonra önemli ölçüde artmış ve 15 dakikada yüksek kalmıştır. Sahte renkli görüntüler, antrenman öncesi ve sonrası belirgin floresan değişiklikleri gösterdi. Anestezi uygulanmış sineklerde, eğitim sonrası CS+'ya verilen kalsiyum yanıtları sadece kısmen azaldı ve CS-'ye verilen yanıtlar taban çizgisinden önemli ölçüde farklı değildi. Kantitatif analiz, anestezi uygulanmış sineklerde eğitim sonrası CS+ yanıtının önemli ölçüde depresif olduğunu doğruladı, ancak CS yanıtları istatistiksel olarak değişmeden kaldı. Plastisite, anestezi uygulanmayan sineklerde anestezi uygulananlara göre anlamlı olarak daha yüksekti.