Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Aracı: Hepatik İntravital Mikroskopi İçin Yeniden Kullanılabilir 3D Baskılı Bir Araç

Bu prosedürün genel amacı, özellikle karaciğer araştırmalarında yüksek kaliteli, dinamik biyolojik verilerin toplanmasında çığır açan bir araç olarak Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Aracı (RHIT) ile tanıtmaktır. Kontrollü deneylerde fareleri incelemek için geleneksel bilimsel yöntemler uzun süredir davranışsal gözlem, fizyolojik izleme ve genetik analizlere dayanmaktadır. Bu çalışmaların karmaşıklığı sıklıkla tutarsız veya sınırlı veri çıktılarına yol açar.

Birçok deney, ya eksik ya da yorumlanması zor olan verilere dayanır; örneğin, kısa süreli düşük çözünürlüklü görüntülerin kısa flaşları ve uzun vadeli eğilimleri yakalamayı veya ince değişiklikleri yakalamayı zorlaştırır. RHIT'i tanıtıyoruz; karaciğer araştırmaları ve ötesinde dinamik, yüksek çözünürlüklü yakalamayı mümkün kılıyoruz. Gösterdiğimiz teknik, erişilebilir malzemeler ve yaygın 3D baskı teknolojisi kullanılarak özel görüntüleme araçlarının üretilmesini mümkün kılar.

Akademik ve kaynak sınırlı ortamlarda kullanılmak üzere tasarlanmış bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü in vivo görüntülemeyi destekleyecek cihazların hızlı geliştirilmesi ve dağıtımına olanak tanır. Yeniden Kullanılabilir Hepatik Görüntüleme Aracımız (RHIT), karaciğerin intravital mikroskopisi sırasında doku stabilitesini artırmak için geliştirilmiştir. RHIT'in modüler tasarımı, farklı boyutlarda fareleri barındırır ve dinamik metabolik süreçlerin en az fizyolojik bozulmalarla genişletilmiş görüntülenmesini destekler.

RHIT, hafif ağırlığı, termostabilitesi ve mekanik dayanıklılığı nedeniyle seçilen bir termoplastik olan akriloniril, butadien, stiren ve ABS kullanılarak tek adımda üretilir. Malzeme yoğunluğunu ayarlayarak, RHIT solunum ve kalp atışından kaynaklanan hareketi etkili bir şekilde emer, böylece görüntü artefaktlarını azaltır ve netliği artırır. ABS'nin kimyasal hareketsizliği ve su çözünmezliği, biyolojik doku ile erişilebilirliği sağlar ve verimli temizlik ve yeniden kullanım sağlar.

RHIT'i yeniden oluşturmak için 3D ürün tasarım yazılımı kullanın. Bu tasarım için Autodesk Inventor kullanıldı. Autodesk Inventor'ı aç ve yeni standart bir parça oluştur.

Dosyayı uygun açıklamayla kaydedin. RHIT'in eskizini ön düzlemde 2D eskiz oluşturma özelliğini kullanarak oluşturun. Dikdörtgen simgesine tıklayın ve eskiz düzleminin başlangıcına sol alt köşesini yerleştirin.

İlk dikdörtgenin içine ikinci bir dikdörtgen çizerek RHIT'in görüntüleme penceresini temsil et. Boyut özelliğini kullanarak her iki dikdörtgene boyut ekleyin; böylece tüm uzunluk ve genişlikler orijine ve birbirine göre referans gösterilir. RHIT boyutlarını fare boyutuna göre ayarlayın.

RHIT'e sadece dış dikdörtgeni seçerek kalınlık ekleyin ve ekstrüde aracıyla eskizi ekstrüze ederek ortada bir açıklık bırakın. Ekstrüze edilmiş RHIT'in alt yüzünü seçin ve başlat 2D eskiz özelliğini kullanarak yeni bir 2D eskiz başlatın. Isı pedinin cebini belirlemek için bir dikdörtgen çizin.

Bu yuvaya yerleştirilecek ısı pedinin boyutu ve kalınlığına göre dikdörtgenin boyutlarını tanımlayın. Bu ölçümler, memelinin doğru sıcaklık modellemesini sağlamak için kullanılacak fiziksel ısı pediyle uyumlu olmalıdır. Gerekli boyutları boyut özelliğini kullanarak uygulayın.

2D eskizden çıkın ve kesilmiş ekstrüz aletiyle malzeme çıkarımı yaparak ısı pedi için derin bir boşluk oluşturun. Eskizi tam olarak konumlandırmak için gerektiği kadar yakınlaştırın. Sıcaklık probu için boşluk yüzeyinin üzerinde yeni bir taslak başlatın.

2D bir eskiz başlat seçeneğine tıklayın ve daire simgesini seçin. Çemberi düz yüzeye yerleştirin ve buna göre boyutlandırın. Eskiz modundan çık.

Ekstrüze tuşuna tıklayın ve dairenin eskizini seçin. Ekstrüzyon modunda, malzemeyi kesmek, ekstrüzyon etmek ve çıkarmak tuşlarına tıklayın. Daireyi cep insertiyle birlikte yüzün sağ tarafına yerleştirin.

Henüz ortalamasına gerek yok. RHIT'in kalınlığının merkezine hizalamak için boyutlar ekleyin. Ekstrüzyona tıklayın.

Kesim yönünü gösteren bir ok ve tamamen geçiş seçeneği ile birlikte bir açılır pencere açılır. Tüm materyali kesmek için hepsini seçin, sonra tamam tuşuna tıklayın. Ekstrüzyon modundan çıkın.

Fileto simgesine tıklayarak pencerenin kenarlarına fileto ekleyin ve sekiz keskin kenarın tamamını seçin. Fileto boyutunu ekle ve fileto modundan çık. Modeli 3D baskıya hazırlayın; ortam sekmesine gidip 3D baskı sekmesini seçin.

Değiştirilmemiş RHIT'i yazdırmak için, STL dosyasını şekil 1A'dan veya ek materyallerden A 3D baskı hazırlık yazılımına aktarın. İçe aktarma tuşuna tıklayın, dosyayı seçin ve hazırla'a tıklayarak modeli yazdırılabilir katmanlara ayırın. Uyumlu bir ticari 3D yazıcı seçin ve baskıya tıklayın.

Baskı sürecini takip edin. Tamamlandıktan sonra, basılmış RHIT'i dikkatlice çıkarıp gerektiğinde temizleyin. Ameliyat ve görüntülemeye başlamadan önce ejeksiyondan 10-15 dakika sonra bekleyin.

Mikroskop hazırlığı ve RHIT'in kullanımı. Karaciğer IBN için geleneksel bir ters konfokal mikroskob hazırla, şekil 2A'da gösterildiği gibi. Numuneyi yerleştirmek için sahne adaptörünü takın.

Bu protokol için, 35 milimetrelik dairesel açılış ve 40 milimetrelik bir kapak camı olan özel yapılmış metal bir insert kullanıldı. Görüntü öncesi ve sonrası kapak camının her iki tarafını iyice temizleyin, gerekirse %70 etanol kullanın. Fare boyutuna göre uygun RHIT'i, metal ekleme üzerine kapak camının üzerine bantla yerleştirilmiş şekilde görüntü kaplama slipine paralel olarak objektif lens ile hizalamayı (şekil 2G'de gösterildiği gibi) sabitleyin.

Görüntüleme için hedefi, alan boyutu, mekansal çözünürlük ve görüntüleme süresine göre seçin; örneğin 95 suya 25X objektif gibi. Hedefi örtü camına yakın düzleştirin. Islak pencerenin üzerine bantla bir gazlı bez şeridi sabitleyin.

Bu, dokunun konumlandırılmasına ve diğer karın organlarından ayrılmasına yardımcı olur. RHIT'i yuvaya yerleştirilmiş bir ısı pediyle önceden ısıtın ve ısı probunu RHIT'in yanına sabitleyin; bu şekil 2G'den H'ye kadar gösterilmiştir. Bu, görüntüleme sırasında farenin vücut sıcaklığını korur. Karın tüyünü saç makası ve/veya tüy alma kremi ile tıraş edin.

Saç kalıntılarını kaldırın ve açıkta kalan cildi %70 etanol ile dezenfekte edin. Kurumsal IACUC gereksinimlerine bağlı olarak, uygun cerrahi alan hazırlığını sağlamak için Betadine ve etanol'ün dönüşümlü bir fırçası kullanılabilir. Hayvan üzerinde ameliyat öncesi anestezi derinliğini yeniden değerlendirin.

Karaciğeri, kaburga kafesinin altından xiphoid'dan alınan cerrahi makasla yatay hilal şeklinde iki ila santimetre şeklinde bir kesi açarak açığa çıkarın; bu kesik üst karın üst karının sol yan tarafında sona erer. İlk kesiden sonra, kas katmanında dikkatlice daha küçük ikincil bir kesi yapın ve karaciğerin sol lobunu ortaya çıkarın. Kanama önlemek için gerektiğinde koterize edin.

Koterizörü kullanırken karaciğere ısıyla ıslatılmış bir gazlı bez yerleştirerek kasın yayılan ısısını emmek için karaciğer ile kas tabakası arasında tuzlu bir gazlı bez yerleştirerek karaciğere sıcaklık hasarını önleyin. Aşırı kanama, cerrahi veya mekanik travma veya dış kompressiyondan kaçının. Karaciğer maruz kaldıktan sonra fareyi mikroskop aşamasına geçirin.

Farenin mikroskop aşamasında konumlanması. Anestezi altındaki farenin karnını mikroskobun RHIT platformunun üstüne aşağıya bakacak şekilde konumlandırın. Burun konisini farenin anestezi altında kalması için ayarlayın.

Karaciğerin sol lateral lobunu örtü slipine nazikçe yönlendirmek için tuzlu pamuk uçlu aplikatör kullanın ve göğüs boşluğuna nazikçe dış basınç uygulayın. Yerçekiminden faydalanarak karaciğeri dikkatlice dışarı çıkarıp kapağı camın üzerine yönlendirin. Karaciğeri farenin vücudundan nazikçe ayırmak için gazlı bez şeridi kullanın.

Görüntüleme sırasında farenin anestezi altında kaldığından emin olmak için burun konisini tekrar kontrol edin. Açıkta kalan boşluğun kenarlarına su bazlı bir jel uygulayarak ve ısı pediyle doğrudan temas etmemek için doku susuzluğunu önleyin. Kapalı nem odasına sahip bir mikroskop da sıcaklık ve nemi korumaya yardımcı olabilir.

Korneanın kurumasını önlemek için gözlere oftalmik merhem uygulayın. Son olarak, görüntülemeye başlamak için timelapse IVM kurun. Lazer kepenkleri açın, floresan etiketlemeleri değerlendirin ve dikkat çekici bir kan akışı olan kararlı bir bölgeyi belirleyin.

Uygun görüntü alımlarını seçin; format, hız, görüntü aralıkları ve zaman uzunluğu, kare ortalaması vb. Gerekirse Z-yığınları için üst ve alt sınırları tanımlayın ve timelapse kaydını başlatın. Protokolümüzü doğrulamak için, şekil 3D'de gösterilen yapısal benzerlik indeksi (SIM) kullanılarak görüntü kararlılığını nicelikle ölçtük.

SIM, parlaklık, kontrast ve yapısal desenlere dayalı iki görüntüyü karşılaştırır. Bir değeri mükemmel benzerliği gösterirken, sıfır bozulmayı gösterir. Şekil 3C, RHIT'in sürekli olarak en yüksek SIM değerleri verdiğini, hiç ekleme yapmadan 50 katına kadar yüksek olduğunu ve üstün görüntü kalitesi gösterdiğini göstermektedir.

A'dan C'ye kadar etiketlenmiş görüntülerde, stabilizatör olmadan, karton iç ve RHIT'li karaciğer IVM'i karşılaştırdık. RHIT, macentadaki lipid damlacıklarını, yeşilde çekirdekleri ve siyandaki damarları net çözünürlüğü korur. Siyah ve beyaz insetler görüntü kararlılığını vurgular.

RHIT ayrıca, birinci filmde gösterildiği gibi, obez farelerde uzun süreli IBM'i sekiz saatten fazla süreyle mümkün kıldı. Bu sonuçlar birlikte, RHIT'in görüntüleme kalitesini ve koşullar arasında tekrarlanabilirliği önemli ölçüde artırdığını doğruladı. Bir arada, RHIT geleneksel olarak hepatik IBM için gereken karmaşık kurulumu basitleştirerek hem tekrarlanabilirliği hem de erişilebilirliği artırır.

Bu yaklaşım, gelişmiş görüntüleme protokollerinin standartlaştırılması için 3D baskıdan yararlanmaya yönelik daha geniş bir hareketi öngörmektedir. Karaciğer görüntülemenin ötesinde, RHIT'in tasarım prensipleri organ tomografisi, malzeme bilimi ve mühendislik gibi diğer uygulamalara da genişletilebilir; burada görüntü satikliği için hareket kararlılığı kritik öneme sahiptir.