Dev tek katmanlı vezikülleri güvenilir bir şekilde hazırlamak için damlacık transfer yöntemini kullanma

Tedavileri yerel olarak uygulamak için vücut dokularında gezinen hücre benzeri mikrorobotları hedefliyoruz. Dev tek katmanlı veziküllere ve fosfolipidik bir zara dayanırlar ve aktif parçacıklar içerirler. Bu protokol, sentetik biyolojide ve diğer alanlarda, örneğin mikrorobotikte damlacık transfer yöntemini benimsemek ve uyarlamak isteyen yeni başlayanlar için bir rehber sunmaktadır.

Diğer GUV hazırlama teknikleriyle karşılaştırıldığında, bu protokol yüksek kapsülleme verimliliği ve basit uygulama sunarak, temel laboratuvar ekipmanına sahip herhangi bir araştırma grubu için erişilebilir olmasını sağlar. GUV tabanlı mikrorobotların doku benzeri ortamlarda navigasyonunu değerlendireceğiz ve hastalıklı hücrelere doğru otonom hareketi sağlamak için algılama stratejileri uygulayacağız. Başlamak için, torpido gözünü kimyasal bir başlığın içine veya yanına hareket ettirin.

Torpido gözünü açın ve haznenin dibine silika parçacıklarıyla dolu bir kristalleştirici yerleştirin. Kristalleştiriciyi beyaz bir destek yüzeyi ile örtün ve ardından kağıt havlularla kaplayın. Gerekli tüm malzemeleri torpido gözüne yerleştirin ve kloroform solüsyonunu içeren cam şişeyi operatör tarafına mümkün olduğunca yakın konumlandırılmış bir mantar halka tutucuya veya 150 mililitrelik bir behere yerleştirin.

Şimdi torpido gözünü kapatın, iki yarının güvenli bir şekilde hizalandığından ve kaymadığından emin olun. Hazneyi tamamen kapatmak için verilen plastik vidaları kullanın. Çıkış vanasını kapatın ve beş numaralı boruyu yarısı suyla dolu 500 mililitrelik bir behere daldırın.

Ardından, iki numaralı borunun valf ayarlı ucunu vakum hattına bağlayın. Ardından, diğer ucunu üç numaralı boruyu kullanarak nitrojen hattına bağlayın. Valfi açın ve eldivenler şişene ve bükülemeyecek kadar sertleşene kadar vakum hattını açın.

Ardından hem vakum hattını hem de vanayı kapatın. Ardından, eldivenler sönene ve torpido gözünden dışarı çıkana kadar nitrojen hattını açın. Eldivenleri giydikten sonra, kloroform çözeltisi içinde belirtilen hacimdeki DOPC'yi koyu renkli bir cam şişeye aktarmak için bir Hamilton şırıngası kullanın.

Şişeyi iğneleri içeren kapakla kapatın. Şimdi, iki yönlü bağlantıları kullanarak altı numaralı boruyu sekiz numaralı boruya ve yedi numaralı boruyu dokuz numaralı boruya bağlayın. Eldivenleri torpido gözünden çıkarın ve çıkış valfini açın.

Daha sonra nitrojen hattını yavaşça açın ve beherdeki kabarcıklar için gaz akışını izleyin. Sabit ancak gözlemlenebilir bir kabarcıklanma hızına ulaşılana kadar nitrojen akışını kademeli olarak artırın. Üç dakikalık akıştan sonra nitrojen hattını kapatın.

Son kabarcık beherden çıktığında çıkış vanasını kapatın. Eldivenleri tekrar takın ve sekiz ve dokuzuncu boruları iki yönlü bağlantı noktalarından ayırın. Ardından, şişeyi açın ve kapağı 50 mililitrelik tüpe geri getirin.

Ardından yağ şişesini açın ve gerekli miktarda yağı koyu renkli şişeye aktarın. Şişeyi tekrar kapakla kapatın, eldivenleri çıkarın ve torpido gözünü açın. Kapalı lipid süspansiyon şişesini en az 30 saniye kuvvetlice vorteksleyin.

Daha sonra 80 santigrat derecede bir su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Şişeyi tekrar vorteksledikten sonra, gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Makas kullanarak kapağı beş mililitrelik bir tüpten kesin.

P1000 pipet ucunu takmak için kapağın ortasına yaklaşık sekiz milimetrelik bir delik açın. Delik uca sığmayacak kadar genişse, kapağı atın ve yenisiyle yeniden başlatın. İkiye beş santimetrelik bir zımpara kağıdı şeridi ile, delinmiş deliğin kenarlarını düzleştirin.

Kapağı beş mililitrelik tüpe geri yerleştirin ve kalan plastik parçacıkları ortadan kaldırmak için beş dakika boyunca 3.000 g'da santrifüjleyin. Ardından kapağı çıkarın ve tüpü atın. Şimdi, kapağı yeni bir beş mililitrelik tüpten kesin ve hazırlanan delikli kapakla değiştirin.

Daha fazla aşağı doğru hareketi önlemek için, uç ile kapak arasında kilitli bir O-halkası bulunan delikten bir P1000 ucu sokun. Tüpü uçtan 5,5 mililitre dış solüsyonla doldurun. Daha önce hazırlanmış lipid süspansiyon şişesini en az 30 saniye vorteksleyin.

Daha sonra 50 santigrat derecelik su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Daha önce hazırlanan su çözeltilerinin oda sıcaklığında en az 10 dakika dengelenmesine izin verin. Şimdi, 300 mikrolitre dış çözeltiyi 1,5 mililitrelik bir tüpe veya önceden değiştirilmiş beş mililitrelik tüpe pipetleyin.

Yağ çözeltisinin üzerine yavaşça 100 mikrolitre lipit süspansiyonu katlayarak iki farklı ve sürekli fazın oluşmasını sağlayın. Arayüzün dengelenmesi için 10 dakika boyunca rahatsız edilmeden durmasına izin verin. İki mililitrelik bir tüpte, %2,5'lik bir yağ içinde su emülsiyonu hazırlamak için 250 mikrolitre lipid süspansiyonunu ve ardından 6,25 mikrolitre iç çözeltiyi pipetleyin.

Emülsiyon homojen ve stabil görünene kadar iki fazı karıştırın. Hazırlanan emülsiyonun 200 mikrolitresini daha önce oluşturulmuş yağ çözeltisi lipid süspansiyon arayüzüne aktarın. 1,5 mililitrelik bir tüp kullanıyorsanız, tüpü kapatmanız yeterlidir.

Modifiye edilmiş beş mililitrelik tüp kullanılıyorsa, pipet ucuna lastik bir kapak yerleştirin ve tüpün tamamını yavaşça 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Tüpleri oda sıcaklığında uygun hızda santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, altta opak bir pelet bulunduğunu ve üstte yağ fazının temiz olduğunu doğrulayın.

GUV'ları içeren beş mililitrelik tüpten yağı çıkarmak için, lastik kapağın yerinde kaldığından emin olarak pipet ucunu tüpten çıkarın. Ucu atın ve lastik kapağı, O-ringi ve tutma kapağını ileride kullanmak üzere saklayın. Bunun yerine, 1,5 mililitrelik bir tüp kullanıyorsanız, yağ çözeltisini çıkarmak için bir P1000 mikropipet kullanın, geride yaklaşık 50 mikrolitre bırakın ve peleti rahatsız etmediğinizden emin olun.

Pipet ucunu değiştirin, ardından peleti çözeltinin kalan 50 mikrolitresinde yeniden süspanse edin. Son olarak, yeniden süspanse edilen malzemeyi iki mililitrelik temiz bir tüpe aktarın. Yüksek nem koşulları altında hazırlanan lipid çözeltileri, nem kontrollü bir odada hazırlananlara kıyasla önemli ölçüde daha düşük verime ve daha fazla düzensiz agrega prevalansına sahip dev tek katmanlı veziküller üretti, ancak ikincisinde bazı agregalar hala mevcuttu.

20 dakika boyunca 3.300 g'da, sakaroz yüklü veziküllerin verimi ve kalitesi optimalken, hem düşük hem de daha yüksek santrifüjleme hızları, düşük verim veya agrega oluşumu gibi olumsuz sonuçlara izin verdi. Mineral yağ, daha büyük bir ortalama çap dağılımına sahip veziküllerle sonuçlanırken, silikon yağı AR 20, önemli ölçüde daha yüksek bir genel vezikül sayısı üretti.