Işık Tabakası Floresan Mikroskobu Kullanılarak Reperfüze Akut Miyokard Enfarktüsünde Kardiyak Hasar ve İmmün Yanıtın Eşzamanlı 3D Analizi

Miyokard enfarktüsünden sonra bağışıklık hücreleri ile hasarlı doku arasındaki etkileşime bakıyoruz. Bağışıklık tepkisini anlamayı ve kalp fonksiyonunu iyileştirmeyi amaçlıyoruz. Miyokard enfarktüsünden sonra, üç ana hücresel varlığın tümünün, kardiyomiyositlerin ve hücrelerin ve bağışıklık hücrelerinin aynı anda çok hedefli stratejilerle modüle edilmesi gerektiği öne sürülmüştür.

Kardiyak hasar ve yanıtın eş zamanlı analizine ek olarak, daha önce bilinmeyen bu hasarlı alanların 3 boyutlu lokalizasyonunu da gösterebildik. 3D analiz, özellikle çeşitli hedefleri çoğullarken, miyokard enfarktüsünden sonra hücresel bileşimi değerlendirmek için daha sağlam bir yol sağlar. Başlamak için, ötenazi yapılmış fareyi stereo mikroskop altına yerleştirin.

İnce makas kullanarak göğüs boşluğunu açın ve göğüs kafesinden boyuna damarın çıkışına yakın açıkta kalan superior vena kavayı kesin. Bir silindir pompasına bağlı 27 gauge iğne kullanarak, heparin içeren PBS ile sağ ve sol atriyal kehanetler yoluyla kalbi in situ perfüze edin. Kalbin yüzeysel damar çiziminin solmasını ve akciğer ile karaciğerin beyazlamasını gözlemleyerek yeterli kardiyak kan çıkarıldığını doğrulayın.

Kalbi, kalan aort ve çevresindeki akciğer dokusunun en az beş milimetresi ile birlikte forseps ve makas kullanarak çıkarın ve buz gibi PBS ve gazlı bezle önceden doldurulmuş altı santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Şimdi, kalan akciğer, yağ ve damar dokusunu, yalnızca yaklaşık beş milimetre aortlu kalp kalana kadar kesin. Kalbi aort kanülasyonu için hazırlanmış bir tabağa aktarın ve kalan aortu 20 gauge künt çelik bir kanülün üzerine çekin.

Güzel bir 5-0 dikişle kanül çentiğine sabitleyin. Sol ön inen arteri, reperfüze akut miyokard enfarktüsünün indüksiyonu için kullanılan yere 6-0 dikişle kalıcı olarak eğin. Yerleştirilen kanül yoluyla retrograd olarak bir LexaFluor 546 ile etiketlenmiş 20 mikrogram fare NT CD31 antikoru içeren 400 mikrolitre PBS enjekte edin.

Kanülü aorttan dikkatlice çekin ve kalbi 10 mililitre% 4 paraformaldehit içeren 15 mililitrelik bir polipropilen reaksiyon tüpüne aktarın. Tüpü gece boyunca karanlıkta çalkalamadan dört santigrat derecede inkübe edin. Sabitlenmiş kalbi, beş mililitrelik polipropilen reaksiyon tüpleri içinde çalkalama için baş üstü rotasyon kullanarak, karanlıkta oda sıcaklığında her biri 10 dakika boyunca beş mililitre PBS'lik üç değişiklikle yıkayın.

Sabitlenmiş kalbi, karanlıkta oda sıcaklığında en az iki saat boyunca deiyonize suda beş mililitre %50 etanol içinde kurutun ve beş mililitrelik reaksiyon tüplerinde baş üstü rotasyonla çalkalayın. Susuz kalmış kalbi ağartmak için, %5 dimetil sülfoksit ve %5 hidrojen peroksit ile 10 mililitre %100 etanol içeren 15 mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın ve çalkalamadan dört saat boyunca karanlıkta dört santigrat derecede inkübe edin. Ağartılmış kalbi, beş mililitrelik reaksiyon tüplerinde çalkalama için baş üstü rotasyon kullanarak, karanlıkta oda sıcaklığında her biri 12 saat boyunca üç kez beş mililitre %100 etanol içinde yıkayın.

Kalbi dört mililitre etil sinamat içeren beş mililitrelik bir reaksiyon tüpüne aktarın ve karanlıkta oda sıcaklığında üç gün boyunca çalkalamadan inkübe edin. Temizlenmiş jel ve sakız bloklarını, mikroskop numune tutucusunda temizlenmiş kalbi stabilize edecek bir boyuta kesin. Görüntü elde etmek için 0.1 milimetre çalışma mesafesine sahip 17.6 sayısal açıklıklı objektif lens kullanın.

Ardından, uygun uyarma ve emisyon filtresi ayarlarını kullanarak floresan sinyallerini tespit edin. Işık tabakası mikroskobu görüntüleme için, 0,079'luk bir tabaka sayısal açıklığı seçin, bu da beş mikrometrelik bir ışık tabakası kalınlığı elde edilmesini sağlar. İki ayrı Z düzlemi arasındaki mesafeyi 10 mikrometreye ayarlayın.

Numunenin homojen bir şekilde aydınlatılmasını sağlamak için %100'lük bir tabaka genişliği kullanın. Bu şekilde, risk altındaki alanı, endotel hasarını ve çok kanallı antikor boyama ve otofloresan kullanan infiltre nötrofilleri lokalize eden temsili kalp dilimleri gösterilmektedir. Risk altındaki alan, retrograd enjeksiyondan sonra CD31 boyanmasının olmaması, intravenöz CD31 negatifliği nedeniyle endotel hasarı ve çoğunlukla yaralanma bölgelerinin yakınında olmak üzere Ly6G pozitif noktaların infiltre nötrofil olması ile belirlendi.

3D görüntüler, AAR, endotel hasarı ve nötrofil kümeleri arasında örtüşme gösterdi ve bu da bölgeye özgü bağışıklık lokalizasyonunu düşündürdü. Ölçüm, AAR'deki nötrofillerin %90.2'sini, uzak bölgelerde ise %9.8'ini gösterdi ve bu da lokalize inflamasyonu gösterdi. AAR içinde, nötrofillerin %79.3'ü endotel hasar hacimlerinin dışında ve %20.7'si içindeydi, bu da hasar etrafında periferik kümelenmeyi düşündürdü.