Uzun Okuma Dizileme Teknolojilerini Kullanarak Amplikon Dizileme

Taşınabilir uzun okuma dizilemesinin, kaynak sınırlı ortamlarda altın standart yöntemiyle karşılaştırılabilir doğrulukla TB'ye dirençli duyarlılık sonuçları sağlayıp sağlamayacağını araştırıyorum; böylece erişilebilir, yüksek kaliteli tüberküloz tanılarını geliştiriyor. İlaç dirençli tüberküloz için hedefli yeni nesil dizileme yöntemini kullanarak biyoinformatik uzmanlık olmadan doğrudan klinik örnekten kapsamlı bir direnç profili sunmak. Uzun okuma dizileme kullanan protokolümüz, gerçek zamanlı direnç tespitinden daha hızlı teslim süreleri, daha basit iş akışı sağlama, kapsamlı TB tanısını kolaylaştırma ve kaynak kısıtlı ortamda salgın takibini minimum altyapı ile geliştirme potansiyeline sahiptir.

Başlamak için, konsantrasyona göre her amplikon örneğinden 100 nanogram hesaplayın ve gerekli hacmi temiz bir PCR tüpüne aktarın. Örnekteki toplam amplikon kütlesini belirlemek için verilen formülü kullanın. Her örneğin toplam hacmini nukleazsız su kullanarak 12,5 mikrolitre ayarlayın.

Örnekleri 10 kez yukarı aşağı pipetle nazikçe karıştırın ve kısa bir süreliğine mikrosantrifüjde çevirin. Sonrasında, her numuneye 1,75 mikrolitre son onarım ve adenylasyon reaksiyonu tamponu ekleyin, ardından 0,75 mikrolitre son onarım ve adenilasyon enzim karışımı eklenin. Örnekler karıştırıldıktan ve döndükten sonra, tüpleri termosiklere 25 derece sıcaklıkta 30 dakika boyunca, ardından 30 dakika boyunca 65 derece Celsius sıcaklığına yerleştirin.

Yerel barkod ligasyonu için, ekranda gösterilen bileşenleri yeni PCR tüplerinde ekleyin. Reaksiyonları pipetle nazikçe karıştırın ve mikrosantrifüj ile kısa bir süre spin yapın. Sonra, her tüpe bir mikrolitre EDTA ekleyin.

Sonra, daha önce gösterildiği gibi iyice karıştırın ve kısa bir süreliğine çevirin. Barkodlu örnekleri 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne çekin. DNA temizleme boncuklarını vortex ile tamamen yeniden askıya alın ve toplanan örnek hacminin 0,7 katına eşit bir hacim ekleyin.

Boncuk örneği çözeltiyi karıştırın ve oda sıcaklığında HulaMixer'da 10 dakika kuluçka yapın. Sonra, %80 etanol içeren iki mililitre hazırlanmak için 1.600 mikrolitre saf etanol ile 400 mikrolitre nükleazsız su karıştırın. Tüpü manyetik bir rafın üzerine beş dakika boyunca koyun, ta ki eluat berrak ve renksiz görünene kadar.

Sonra, süpernatantı pelleti rahatsız etmeden çıkarıp at. Boncukları 700 mikrolitre taze hazırlanmış %80 etanol ile yıkayın ve tüpü kısa süreliğine santrifüjleyin. Tüpü manyetik rafa yerleştirdikten sonra, kalan etanolü çıkarın.

Şimdi, manyetik raftan tüpü çıkarın. Boncukları 35 mikrolitre nükleazsız suya nazikçe sallayarak tekrar askıda bırakın ve 37 derece Celsius'ta 10 dakika kuluçka yapın. Tüpü manyetik rafa geri getirin, ta ki eluat berrak ve renksiz hale gelene kadar.

Sonra, 35 mikrolitre elüatı temiz bir 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne aktararak daha fazla kullanım için alın. Adaptör ligasyonu için, verilen bileşenler 1,5 mililitrelik düşük bağlanma mikrosantrifüj tüpünde karıştırılır. Tüpü kısa bir süre santrifüjle edin ve oda sıcaklığında 20 dakika kuluçka yapın.

DNA temizleme boncuklarını tamamen askıya almak için vortex yapın. Tüpe 20 mikrolitre boncuk ekleyin ve nazikçe karıştırın. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca HulaMixer üzerinde kuluçka yapın.

Sonra, tüpü manyetik bir rafa yerleştirerek boncukları pellet yapın ve süpernatantı peleti rahatsız etmeden emin. 125 mikrolitre kısa parça tamponu ekleyin ve boncukları yeniden süslemek için tüpü nazikçe çevirin. Kısa bir süreliğine santrifüj yapın ve tüpü manyetik rafa geri döndürün.

Boncuklar peletlendikten sonra üst yüzeyi tekrar aspire edin. Şimdi, tüpü manyetik raftan çıkarın ve boncukları 15 mikrolitre elusiyon tamponunda nazikçe pipetleme veya titretme ile yeniden askıya alın. İçeriği toplamak için tüpü kısa bir süreliğine santrifüjlendirin, ardından 37 derece Celsius'ta 10 dakika kuluçka geçirerek DNA'yı elüasyon edin.

Tüpü manyetik bir rafın üzerine yerleştirin, ta ki eluat berrak ve renksiz hale gelene kadar. Sonra, 15 mikrolitre eluat aspirasyonu alın ve temiz, 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Akış hücresi priming çözeltisini hazırlamak için, verilen bileşenleri iyice karıştırın.

Akış hücresinin priming portunu açın, yaklaşık 20 mikrolitre tampon çekerek hava kabarcıklarını çıkarın ve hava kabarcıkları oluşmadan 800 mikrolitre astar karışımını porta yükleyin. DNA kütüphanesini hazırlamak için, ekranda gösterilen bileşenleri iyice karıştırın. Akış hücresinin örnek port kapağını nazikçe kaldırın, hava kabarcıkları oluşmadan astar portuna 200 mikrolitre priming karışımı yükleyin.

Hazırlanan DNA kütüphanesi karıştırdıktan sonra, kütüphaneden 75 mikrolitreyi dizileme akış hücresi numune portuna damla yükleyin. Akış hücresi numune portunun kapağını kapatın, böylece tıkanın örnek portuna güvenli bir şekilde girdiğinden emin olun, ardından astar portunu sıkıca kapatın. Jel elektroforezi, neredeyse tüm örneklerde amplikon bütünlüğünü doğruladı, ancak 89 ve 136 örneklerine karşılık gelen şeritlerde soluk veya eksik bantlar görüldü.

89 ve 136 örneklerinde amplikon konsantrasyonları yetersiz olduğundan, uzun okuma dizilemesinden çıkarıldılar. Tüm hedeflenen genler boyunca, uzun okuma ve kısa okuma platformları yüksek kapsama derinliklerine ulaştı; EIS geni en yüksek ortalama değerleri, RRS geni ise en düşük kapsama derinliklerini gösterdi. Kapsama derinliği aralığına rağmen, her iki platform da dirençle ilişkili tüm genlerde %99,9 kapsama alanını korudu.

Ethambutol, florokinolonlar, kanamisin, amikasin ve kapreomisin için ilaç direnç varyantları, kısa ve uzun okuma dizileme platformlarında %100 uyum oranı ile tespit edildi. Linezolid, bedaquiline ve klofazimin için herhangi bir dizileme yöntemiyle dirençle ilişkili mutasyon bulunmadı. Streptomisin direnci tespiti, platformlar arasında daha düşük uyum gösterdi ve sadece %71,43 uyum sağladı.

Anahtar genler rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA ve pncA için tespit hassasiyeti platformlar arasında %89,47'den %96,77'ye kadar değişmiştir.