Bireysel Sıçan Nöral Hücrelerinin Lazer Kaynaklı Postiyonizasyon Kütle Spektrometresi ile Floresan Kılavuzluğunda Matris Destekli Lazer Desorpsiyon/İyonizasyon
23 Mayıs 2025
Bu protokol, floresan kılavuzlu, tek hücreli MALDI-2 kütle spektrometresi için mikroMS kullanımını ana hatlarıyla belirtir ve birincil sıçan nöronal hücrelerinin gelişmiş moleküler profilini çıkarmayı sağlar.
Araştırmamız, hücresel heterojenliği ortaya çıkarmak ve moleküler profilleri karmaşık sistemlerde hücre kimliği, işlevi ve tepkisi ile ilişkilendirmek için yüksek verimli, görüntü kılavuzlu, tek hücreli MALDI kütle spektrometresi iş akışları geliştirmeye odaklanmaktadır.
MALDI-2 ve yüksek uzamsal çözünürlüklü kütle spektrometreleri gibi gelişmiş enstrümantasyon, tek hücrelerin hedeflenmiş, uzamsal olarak çözülmüş analizini mümkün kılar, duyarlılığı artırır ve karmaşık dokularda moleküler profillemenin kapsamını genişletir. Mevcut zorluklar arasında sınırlı hassasiyet, örnekler arasında tekrarlanabilirlik ve karmaşık veri analizi yer alır. MALDI verileri genellikle seyrektir ve binlerce hücre ve yüzlerce molekül içeren büyük veri kümeleri sağlam hesaplama araçları gerektirir.
Bu protokol, tek tek hücreleri ve hatta organelleri analiz etmek için yüksek verimli yöntemlerdeki boşluğu ele alarak, heterojenlik hakkında çok ayrıntılı çalışmalara olanak tanır ve moleküler ve hücresel biyoloji ve işlev hakkında bilgi edinir.
Bu protokol, slayt boyunca dağılmış hücrelerin hızlı hedefli analizine izin vererek, hücre manipülasyonu veya tam alan taraması ihtiyacını ortadan kaldırır ve verimi önemli ölçüde artırır.
[Ekran Okuyucusu] Başlamak için, mikroskopi ve MALDI matris uygulamasına müdahale edebilecek gliserol ve tuz kristallerini çıkarmak için her bir slaytı iki ila üç mililitre 150 milimolar amonyum asetat ile durulayın, ardından slaytları hafif bir nitrojen akışı altında kurutun veya tamamen kurumaya bırakın. Kurutulmuş slaytı mikroskop aşamasına yükleyin. Mikroskobu, tüm slayt boyunca eşit olarak dağıtılmış en az 10 destek noktası kullanarak odaklayın. DAPI ve parlak alan görüntüleme için uygun filtreler kullanarak, mikroskopi slaytlarındaki referans işaretleyicilerin görüntüde net bir şekilde yakalanmasını sağlayarak, tüm slaytın 5x ila 10x büyütmede döşenmiş bir floresan görüntüsünü elde edin. Döşenmiş görüntüleri ZEN ZEISS gibi bir mikroskopi yazılımı kullanarak birleştirin. Dikey olarak bitişik döşemelerin ofset olmadığını doğrulayın. Eklenen her görüntüyü, mikroskopi yazılımını kullanarak bir BigTIFF dosyası olarak veya son görüntü boyutu iki gigabayttan küçükse standart bir TIFF olarak işleyin ve dışa aktarın. 20 miligram 2,5-dihidroksiasetofenonu 1.5 mililitre asetonda çözün. Slaytları süblimasyon odasının tutucusuna yerleştirin, ardından tutucuyu süblimasyon aparatına yerleştirin. Çözünmüş matris çözeltisini seramik gofret üzerine pipetleyin ve asetonun tamamen buharlaşmasına izin verin, ardından sızdırmaz hale getirmek için süblimasyon odasını kapatın. Soğutma sıvısı haznesini bir buzlu su ile doldurun ve süblimasyon haznesinin üzerine güvenli bir şekilde yerleştirin. Vakum pompasını açın ve sistemin beş dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Odayı beş dakika boyunca 200 santigrat dereceye ısıtarak süblimasyona başlayın. Beş dakika sonra, buzlu su banyosunu hazneden çıkarın. Sıcaklığı 25 santigrat dereceye getirin ve haznenin üzerine bir soğutucu yerleştirin. Basıncı boşaltmak için süblimasyon odasını yavaşça boşaltın. Hazneyi açın ve slaytları dikkatlice çıkarın. MicroMS'yi açın ve hem parlak alan hem de floresan kanallarını barındırmak için görüntü grubu seçeneğini kullanarak BigTIFF mikroskopi görüntülerini delersiniz. Blob Seçenekleri aracına gidin ve kabul edilebilir blob boyutu aralığını tanımlamak için en yüksek ve en düşük blob boyutunu ayarlayın. Blob algılama için floresan kanalının eşiğini ayarlayın. Tanımlanan hücrelerin dikkate alınmak üzere ne kadar dairesel olması gerektiğini tanımlamak için dairesellik değerini belirtin ve rengi seçin. Blobları algılamak için Blob Bul seçeneğini kullanın. İstendiğinde, blob listesini istenen bir adla kaydedin. Her hücre arasındaki minimum mesafeyi ayarlamak için Mesafe Filtresi aracını kullanın. Ofset hatasını doğru bir şekilde belirlemek için hatayı test noktaları aracılığıyla test edin. MTP Slayt Adaptörü II'yi kullanarak slaytları cihaza yükleyin. MicroMS ile bilgisayara döndükten sonra, uzak masaüstü uygulaması aracılığıyla kütle spektrometresi bilgisayarına erişin. Enstrümanı ilk kez kullanıyorsanız, Araçlar'a ve ardından Cihaz Ayarları'na giderek konumunu doğrulayın. Açılır pencerede, koordinat kümesini X ve Y konumlarıyla görüntüleyin ve Slide Adapter II geometrisinde bu belirli noktaların her birini seçin. MicroMS penceresindeki X ve Y konumlarını güncelleyin. Kütle spektrometresinin kamerasını ve sahne kontrollerini kullanarak, slayt üzerinde kolayca tanımlanabilir bir konuma gidin ve cihaz koordinatlarını kopyalayın. MicroMS'de, mikroskop görüntüsünde aynı konumu bulun, sağ tıklayın ve koordinatları açılır pencereye girin. Koordinatları en yakın tam sayılara yuvarlayın ve bir boşlukla ayırın. Üç kayıt noktası eklendikten sonra, dairelerden biri kırmızıya dönecek ve kayıttan en kapalı konum olduğunu gösterecektir. Control + sağ tıklamayı kullanarak kayıt noktasını silin ve yeniden deneyin. Dosya altında, kayıt dosyasını kaydetmek için Kaydet'e ve ardından Kayıt'a gidin. Slaytta bloblar görünür durumdayken, Dosya, Kaydet'e gidin ve ardından cihaz konum dosyasını kaydetmek için cihaz konumları'na gidin, ardından uzak masaüstü yazılımını kullanarak bu dosyayı cihaz bilgisayarına aktarın. Özel XEO dosyasını açın ve içeriğini MTP Slide Adapter II'ye kopyalayın. XEO dosyası cihaz bilgisayarında. Bu geometri dosyasını hücrelerin konumlarıyla güncellemek için dosyayı kaydedin. Otomasyon sekmesine tıklayın ve yeni bir otomatik çalıştırma oluşturmak için Yeni'yi seçin. Hücreleri seçmek için görüntülenen örnek bölge boyunca sürükleyin ve bunları analiz listesine eklemek için sağ tıklayın. Otomatik çalıştırmayı kaydedin ve alımı başlatmak için Otomatik Çalıştırmayı Başlat'a tıklayın. Bu şekil, tek hücreli MALDI-2 kütle spektrometresi profillemesinin, farklı beyin bölgeleri arasında ve içinde lipid bazlı hücresel heterojenliği nasıl ortaya çıkardığını göstermektedir. Düzgün manifold yaklaşımı ve projeksiyonu veya UMAP analizi, hücreleri beyin bölgesine göre ayırarak striatum, hipokampus ve korteks için farklı kümeler oluşturur. Leiden kümelemesi dört lipid bazlı hücre alt popülasyonunu ortaya çıkardı. Ek olarak, açıklamalı lipitler arasında farklı yoğunluk profilleri ile kümeye özgü lipit imzaları gözlendi. Altı kortikal hücreden elde edilen kütle spektrumları da slaytlar arasında tutarlı lipid tespiti gösterdi. Ayrıca, farklı slaytlardan alınan kortikal hücreler, minimum toplu etkileri gösteren örtüşen UMAP dağılımları gösterdi.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, floresan rehberliğinde tek hücreli MALDI-2 kütle spektrometrisi için microMS kullanma protokolünü sunar ve primer rat nöronal hücrelerinin moleküler profilini artırır. Araştırma, hücresel heterojenliği ele almak ve moleküler profilleri karmaşık dokular içindeki hücresel kimlik ve işlevle ilişkilendirmeyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Kütle Spektrometrisi
- Hücresel Biyoloji
Arka Plan
- Yüksek verimli görüntü rehberliğindeki iş akışları, hücresel heterojenlik çalışmalarını kolaylaştırır.
- Gelişmiş MALDI-2 kütle spektrometrisi, mekansal olarak çözünür analiz sağlar.
- Mevcut zorluklar arasında veri analizi ve hassasiyet sorunları bulunur.
- Büyük veri setleri için güçlü hesaplama araçları gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Bireysel hücreleri analiz etmek için yüksek verimli yöntemleri geliştirmek.
- Moleküler verileri hücresel kimlik ve işlevle ilişkilendirmek.
- Karmaşık sinir sistemlerinin biyolojisi hakkındaki görüşleri artırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Protokol, analiz için tek hücreli MALDI-2 kütle spektrometrisi kullanır.
- Birincil model, primer rat nöronal hücrelerini içerir.
- Adımlar arasında slayt hazırlığı, matrisin süblimasyonu ve hücre tespiti için blob analizi bulunur.
- Ayrıntılı mikroskopi görüntü alımı ve hesaplamalı kaydın kritik öneme sahiptir.
- Veri işleme, kütle spektrometrisi sonuçlarını geliştirmek için özel yazılımları içerir.
Ana Sonuçlar
- Beyin bölgelerindeki lipid bazlı hücresel heterojenliği ortaya çıkarmıştır.
- UMAP analizi, hücreleri beyin bölgesi bazında başarıyla kümelendirmiştir.
- Kümeye özgü lipid imzaları tanımlanarak farklı hücresel profiller vurgulanmıştır.
Sonuçlar
- Bu protokol, kapsamlı manipülasyon olmadan nöronal hücrelerin hızlı, hedefli analizini sağlar.
- Bulgular, nörobilimdeki moleküler ve hücresel biyolojiyi anlamamızı geliştirir.
- Elde edilen görüşler, karmaşık dokulardaki hücresel işlev hakkında gelecekteki çalışmaları bilgilendirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
High-throughput, fluorescence-guided MALDI-2 mass spectrometry enables precise molecular profiling of individual neural cells, addressing the challenge of cellular heterogeneity in complex tissues. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by linking molecular signatures to cell identity and function. The approach supports portfolio decisions by providing scalable, reproducible single-cell data critical for target validation and mechanistic de-risking.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular heterogeneity and molecular pathway mapping at single-cell resolution.
- Supports functional target validation by correlating molecular profiles with cell identity and region-specific biology.
- Facilitates predictive confidence in target selection through robust, high-content molecular data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream high-throughput screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible molecular outputs suitable for assay standardization.
- Reduces data size and increases throughput by targeting only cell locations, optimizing screening readiness.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant neural systems for translational biomarker discovery.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation by supporting cross-slide and cross-region reproducibility.
- Provides mechanistic de-risking through detailed lipid-based cellular subpopulation analysis.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates from early discovery through lead identification, supporting both hypothesis testing and translational research in neuroscience and related fields.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven interrogation of neural cell diversity and molecular function.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for compound evaluation in single-cell contexts.
- Analytics: Delivers high-content, spatially resolved molecular measurements for robust comparative analysis.
- Translational Research: Supports biomarker alignment and preclinical model validation with minimal batch effects.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, reusable workflow for single-cell molecular profiling across diverse projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in neural target validation.
- Operational Value: Standardizes high-throughput, reproducible single-cell analysis with reduced data burden.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio advancement.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by providing robust, cross-sample molecular data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in advanced mass spectrometry and fluorescence microscopy.
- Demands access to MALDI-2 instrumentation and computational infrastructure for data analysis.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for image registration and data processing.
- Adaptable to various neural and potentially non-neural cell systems with appropriate validation.
- Data analysis complexity and reproducibility across samples are critical practical considerations.
