Fotosentetik Mikropların ve Virüslerinin Çevresel Örneklemesi: Tarladan Laboratuvara

Bu projelerin amacı, viral enfeksiyonlardaki fizyolojik parametreleri ölçmek, ardından omik substratları gözlemlenen fizyolojiye eşlemek ve virolojide virüs-konakçı dinamiklerindeki değişiklikleri tahmin eden modellere veya yasalara yol açmaktır. Yüksek verimli dizileme ve kolaylaştırılmış biyoinformatik iş akışlarındaki gelişmelerle, fizyolojik fenomenleri belirli omik substratların bir fonksiyonu olarak açıklama fırsatı sağlayan çoklu omik analizlere kolayca erişilebilir. Deneysel enfeksiyonlar, elektron mikroskobu, kantitatif PCR yeni nesil dizileme ve sağlam biyoinformatik boru hatları kullanan ağ analizleri, tahmine dayalı modellerin geliştirilmesini bilgilendiren omikler ve fizyolojik değişkenler arasındaki ilişkileri belirleyebilir.

En büyük zorluk, deneysel enfeksiyonlar için enfeksiyon çokluğunun belirlenebilmesi için doğru titrelere sahip saf tek genotip virüs stokları oluşturmaktır. Titre tayini virolojide bir sorun olmaya devam etmektedir. Tek konaklı/tek virüslü enfeksiyonlarda bir konakçıyı enfekte eden iki virüs veya farklı konakçıları enfekte eden bir virüs arasındaki nispi virülansı hesaplamak için ölçümler geliştirdik.

Virüs sistemlerinde çalışan bir iş akışını standartlaştırdık. Başlamak için, Güney Kaliforniya kıyı şeridi boyunca açık denizde çevresel örnekleme yapın. Pompanın çıkışına 10 fit uzunluğunda çökmeye dayanıklı kauçuk esnek hortum takın.

Transfer pompası elektrik kablosunu inverter jeneratörüne takın. Monte edildikten sonra transfer pompasını hazırlayın ve pompa sisteminin çalışır durumda olduğundan emin olmak için test edin. 25 metre uzunluğunda, çapı 1,25 santimetre olan naylon deniz halatının bir ucunu 14 kilogramlık mantar çapanın deliğine sabitleyin.

Halatı her üç metrede bir mavi PVC boruya sabitlemek için koli bandı kullanın. Sabit bir su akışı aktarıldıktan sonra, istenen derinlikten gelen suyun pompadan akmasını sağlamak için bir ila iki tüp hacmini okyanusa geri boşaltın. Saha istasyonuna taşımak için 20 litrelik su sürahilerinde su örnekleri toplayın.

Su örneğini bir filtre kabı tertibatından süzün, ardından filtre kabını şeffaf vinil boru kullanarak taşınabilir bir hava diyaframlı vakum pompasına bağlayın. Numuneyi filtre kabına aktarın ve filtrelemeye başlayın. Tamamlandığında, süzüntüyü bir su toplama şişesine aktarın ve etiketleyin.

Şimdi filtreyi filtre kabı tertibatından kesmek için bir neşter kullanın. İkiye bölün ve 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın. Filtrelenmiş deniz suyunun 50 mililitresini aynı santrifüj tüpüne aktarın.

Karışık numuneleri konsantre etmek için, bölgeye göre her numune alma derinliği için, ultrafiltratı hücre kalıntısı yüklü 0,45 mikrometrelik bir filtre ile laboratuvara ve santrifüje geri gönderin. Süzüntünün 60 mililitresini bir sıkma filtresine aktarın. Konsantre etmek için 6.000 G'de 10 ila 20 dakika santrifüjleyin.

1.5 ila 2 mililitre virüs veya bakteriyofaj süspansiyonu konsantresi elde edilene kadar santrifüjlemeyi tekrarlayın. Elde edilen konsantreyi, işlenmiş çevresel numuneden virüslerin veya bakteriyofajın daha fazla transmisyon elektron mikroskobu görüntülemesi için iki mililitrelik bir Eppendorf tüpüne aktarın. Çevresel numuneleri hazırlanan agar plakalarına çizin.

Varsayılan virüs veya bakteriyofaj konakçılarının tek koloni izolatlarını izole etmek için, bir izolatı yeni bir plakaya aktarmak için steril bir aşılama döngüsü kullanın. Daha sonra başka bir koloni seçmek için aynı döngüyü kullanın ve sıvı et suyu içeren konik bir şişeye aktarın. Beş mililitre BG 11 ortamı içeren 20 mililitrelik kültür tüplerinde 10 tohum kültürü hazırlayın.

Numune bölgesinden beş mililitre ultrafiltrat karışımı ve BG-11 ekleyin. Steril bir kürdan ile bir kültür plakasından tek bir koloni izolatı seçin, ardından her tüpe bir kürdan damlatarak her tüpü ayrı ayrı aşılayın. Pozitif tohum kültürü büyümesi tespit edildiğinde, plakalarda yalnızca tek bir koloni fenotipi görünene kadar seri prosedürlerini tekrarlayın.

Sıvı kültür ve katı ortam plakası çalışması döngüleri tek bir hücre fenotipi ile sonuçlandığında, ışık mikroskobu kullanarak mikrobiyal morfotipleri karakterize edin. Virüs aktivitesini tespit etmek için, BG-11 agar plakalarında çalışan stoklardan varsayılan konakçı siyanobakteri veya mikroalg çimleri yetiştirin. Virüs süspansiyonu üzerinde lekelenme veya dönme nedeniyle plakalarda tek tek plaklar göründüğünde, tek bir plağı kazımak için steril bir halka kullanın.

Döngüyü, konağın 10 mililitrelik tohum kültüründe döndürün. Konukçu aralığını belirlemek için, çevresel örneklerden izole edilen veya diğer laboratuvarlardan veya kültür koleksiyonlarından elde edilen birden fazla varsayılan konakçının çimlerini hazırlayın. Enfekte ve enfekte olmamış kültürlerden düzenli zaman aralıklarında 730 nanometre okumalarında optik yoğunluk alarak konakçı büyüme eğrileri oluşturun.

Fotosentetik mikroorganizmaların saf kültürleri, ışık mikroskobu altında farklı morfolojiler sergiledi. Morfolojik özelliklere ve 16S rRNA dizilimine ve ardından filogenetik analize dayanarak, izolatın Merismo PDAC ailesinden bir siyanobakteri türü olduğu belirlendi. Oval şekilli yeşil hücreler gösteren alternatif bir izolat, Synechococcus'u düşündürür.

Synechocystis benzeri SWII suşu, BG-11 agar üzerinde yoğun, tek tip çimler oluşturur ve plaka bazlı plak analizleri için idealdir. FSBL 14 enfeksiyonu, girdaplı çim seri seyreltme plak deneylerinde görünür plak temizliğine neden oldu ve sıvı kültürde SWII suşunun büyümesini engelledi. Büyüme eğrileri, konsantre phi SBL 14 süspansiyonu ile enfekte olmuş SWII'nin, hem seyreltilmiş faj süspansiyonuna hem de enfekte olmamış kontrole kıyasla optik yoğunlukta çok daha yavaş bir artışa sahip olduğunu gösterdi.

Maksimum spesifik büyüme hızı, enfekte olmamış SWII kültürlerinde en yüksekti. Enfekte SWII kültürlerinin transmisyon elektron mikroskobu, enfekte olmamış kontrollerde bulunmayan membran kalınlaşması, iç granüller ve membran gevezeliği gibi sitopatik etkileri ortaya çıkardı.