Hücresel Çözünürlük ile Tam Montajlı Retinal Organoid Görselleştirme

Çalışmamız, insan retinasının nasıl oluştuğunu, hastalıkların nasıl etkilediğini ve bunları nasıl tedavi edebileceğimizi incelemek için in vitro bir insan modeli olarak hizmet eden retina organoidlerini geliştirmeye ve incelemeye odaklanmaktadır.

Rejeneratif tıp alanındaki araştırmaları ilerletmek için, tüm yapıları görselleştirmek ve konfokal mikroskopi ile retina hücrelerinin özel organizasyonunu incelemek için optik temizleme ve immüno etiketleme ile birlikte 3D retinal organoidler kullanıyoruz.

Tam montajlı görüntüleme, yoğun dokularda eşit olmayan antikor penetrasyonu ve organoidlerde küresel sapma gibi doku görselleştirme sırasında yüzey yanlılığı etiketlemesine ve odak kaybına neden olan zorluklarla karşı karşıyadır.

Yöntemimiz, retina hücre bağlantılarını, hücre tiplerini 3 boyutlu organizasyon altında ortaya çıkararak retina hastalıklarının altında yatan nedenlere dair önemli bilgiler sağlar.

[Eğitmen] Başlamak için, susuz DMSO içinde çözülmüş, kurutulmuş ve dondurulmuş florofor alikotlarını elde edin. Bir alikota 1 ila 10 mikrolitre DMSO ekleyin. Şimdi, 50 mikrolitre ikincil immünoglobulin G veya birincil antikor, altı mikrolitre bir molar sodyum bikarbonat ve bir ila beş mikrolitre floroforu birleştirin ve ışıktan korunarak oda sıcaklığında 40 dakika sallanan bir platformda inkübe edin. Reaksiyon ilerlerken, saflaştırma boyutu dışlama sütunlarının kapaklarını çıkarın ve tamponun geçmesine izin verin. Kolon boyunca iki ila üç mililitre PBS'lik üç tur çalıştırarak kolonu dengeleyin. Son dengeleme inkübasyon bitmeden biterse, çekilmelerini önlemek için kapakları geri koyun ve reaksiyonun bitmesini bekleyin. İnkübasyondan sonra, hacmi yaklaşık 200 mikrolitreye getirmek için etiketleme reaksiyonuna 140 mikrolitre PBS ekleyin ve vorteksleyin. Çözümü sütunun ortasına ekleyin ve sütuna girmesine izin verin. Son damla kaçtıktan sonra, çözeltiyi 550 mikrolitre PBS ile itin. Sıvı düşmeyi bıraktığında, 300 mikrolitre PBS ile seyreltin ve 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın. Antikor konsantrasyonunu ve etiketleme oranlarını hesaplamak için numunenin absorbansını 280 nanometrede ve florofora özgü dalga boylarında ölçün. Etiketli antikorları altı aya kadar ışıktan korunarak dört santigrat derecede saklayın. Retina organoidlerini oda sıcaklığında% 4 paraform aldehit ile 45 dakika sabitleyin. Sabitledikten sonra, organoidlerin üzerine antijen alma solüsyonu ekleyin ve kabı bir saat boyunca dakikada 30 devirde hafif çalkalayarak 60 santigrat derecede inkübe edin. Ardından, organoidleri %1 Triton X-100 içeren PBS ile geçirgenleştirin. Karışımı oda sıcaklığında, dört saat boyunca hafifçe çalkalayarak inkübe edin. Şimdi, organoidleri %2 BSA ile %0.1 Triton X-100 içinde oda sıcaklığında gece boyunca veya bir günden fazla bloke edin. Ertesi gün, organoidlere seyreltilmiş birincil antikorlar ekleyin. Hafif çalkalama ile iki gün boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Organoidleri oda sıcaklığında yıkama solüsyonunda 15'er dakika boyunca üç kez hafifçe çalkalayarak yıkayın. Şimdi, seyreltme solüsyonu ikincil antikorlarını ekleyin ve hafif çalkalama ile iki gün boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Organoidleri daha önce gösterildiği gibi yıkadıktan sonra, organoidleri yıkama solüsyonunda seyreltilmiş floresan boyalarla oda sıcaklığında hafif çalkalayarak bir saat inkübe edin. Ardından tekrar yıkayın. Daha sonra, ultra saf suda %15, %30, %45, %60, %75 ve %90 konsantrasyonlarda 1-propanol çözeltileri hazırlayın ve her birini trimetilamin ile pH 9.5'e ayarlayın. Numuneleri, her biri 30 santigrat derecede iki saat boyunca hafif çalkalayarak artan 1-propanol çözelti gradyanlarında sırayla kurutun. Daha sonra numuneyi %100 1-propanol çözeltisine aktarın ve gece boyunca 30 santigrat derecede hafif çalkalayarak inkübe edin. Numune temizleme için, BABB çözeltisi yapmak üzere benzil alkol ve benzil benzoat karışımını bir ila iki oranında hazırlayın. Numuneleri gece boyunca oda sıcaklığında BABB'a daldırın. Görüntülemeden önce BABB solüsyonunu yenileyin. Bir cam pipetle, organoidi bir damla BABB içeren cam tabanlı bir Petri kabına yerleştirin ve kapak camının yüzeyine temas ettiğinden emin olun. Şimdi, 3D hücresel çözünürlük için Z-yığını görüntüleri elde etmek için düşük ve yüksek büyütme hedeflerine sahip ters çevrilmiş bir konfokal lazer tarama mikroskobu kullanın. Temizleme solüsyonu ile daldırma ortamı arasındaki kırılma indisi uyumsuzluğunu hesaba katarak Z-yığını alımının adım boyutunu yeniden kalibre edin. Şimdi, ImageJ'yi başlatın, Görüntü'yü seçip Z-yığınının görüntü projeksiyonlarını oluşturmak için Özellikler'e tıklayarak voksel derinliğini güncelleyin. Retina organoidinin XY, XZ ve YZ görünümlerini görüntülemek için Görüntü'yü, ardından Yığınlar'ı ve Ortogonal Görünümler'i seçerek Z-yığını derinliğini inceleyin. Dosya'ya tıklayıp Farklı Kaydet'i seçerek istediğiniz bölgeleri kaydedin. Son olarak, işleme yazılımını kullanarak Z yığınının 3B görüntüsünün bir animasyonunu oluşturun. Fruktoz gliserol ile temizlenmiş retinal organoidler, şeffaflıkta en az iyileşmeyi göstererek organoid çekirdeğin görselleştirilmesini engelledi. ECI temizleme, retina katmanlarının görüntülenmesini iyileştirdi, ancak yine de kalıcı ışık saçılımı nedeniyle organoid çekirdeği ortaya çıkaramadı. Fluoclear BABB ile temizlenmiş organoidler, tutarlı floresan ile hem korteksi hem de çekirdeği açıkça ortaya çıkararak en yüksek şeffaflığı sergiledi. Hem ECI hem de fluoclear BABB ile temizlenmiş organoidler, dehidrasyon adımları nedeniyle parlak alan görüntülerinde gözle görülür büzülme sergiledi. BABB'nin neden olduğu büzülme, numune kompaktlığını artırarak daha derin yapıları görüntülemek için yüksek büyütmeli hedeflerin kullanılmasını sağladı. İn vitro 40 günde TUJ1 immün etiketlemesi, görünür tabakalaşma olmaksızın tek bir ince nöronal tabaka gösterdi. 90 güne kadar, hücreler apikal bölgeyi yoğun bir şekilde doldurdu ve 170 günde organoid, tanımlanmış bir apikal bölge ile katmanlı organizasyonun açık belirtilerini sergiledi. 200 günde, uzun hücre çıkıntıları yüzeyden çekirdeğe doğru uzandı ve organoid 250 günde üç farklı retina katmanına dönüştü. Nöronal lifler, olgunlaşma boyunca organoid merkezden çevreye doğru uzandı ve in vitro 250 gün içinde daha kalın ve daha karmaşık hale geldi. Mavi ve yeşil/kırmızı opsinleri eksprese eden koni fotoreseptörleri geç evrelerde ortaya çıktı ve parlak uçlu uzun morfolojiler gösterdi. Rodopsin eksprese eden çubuk fotoreseptörleri, merkezi çekirdekleri ve periferik opsin dağılımı ile tanımlandı. Chx10-pozitif hücreler başlangıçta geniş bir alana dağıldı, ancak daha sonra organoid olgunlaşması sırasında spesifik olarak iç nükleer tabakaya lokalize oldu. Endojen GCaMP6s ekspresyonu, BABB temizliğini takiben korundu ve uzun süreli fiksasyondan sonra nöral retinada GFP sinyali saptanabildi.