Name: Hücresel Çözünürlük ile Tam Montajlı Retinal Organoid Görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-20T13:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 20 s
Description: Keşfedin optik temizleme ve immünolabeling ile tam montajlı retinal organoid görüntüleme yöntemini. Bu teknik, konfokal mikroskopi kullanarak 3D hücresel çözünürlükte retinal gelişimi ve hastalık mekanizmalarını detaylı şekilde incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Özel yapım floresan ikincil antikorların hazırlanması
NOT: Bu yaklaşım, ticari floresan antikorların kullanımına bir alternatif olarak hizmet eder (floresan ikincil antikorların hazırlanmasının avantajları için tartışmaya bakınız). Ayrıca, bu protokol, doğrudan immünofloresan yapılması ve floresan primer antikorun ticari olarak mevcut olmaması durumunda, floroforların primer antikorlara konjuge edilmesi için kullanılabilir. Etiketleme reaksiyonundaki florofor miktarını ayarlayarak florofor-antikor oranını kontrol etmek, daha parlak konjuge antikorlar üretir. Bununla birlikte, özel yapım ikincil antikorlar daha az kararlıdır ve elde edilen konjugatın konsantrasyonu, ticari floresan antikorlarınkinden 10 kat daha düşüktür. Bu protokol, Bálint ve ark.9 tarafından açıklanan çalışmadan uyarlanmıştır.
<ol>
	<li>1 mg floroforu susuz DMSO'da çözün ve tüp başına son 0.02 mg florofor için tüplere alikot yapın. 1 saat ve 30 dakika boyunca çalışan bir hızlı vakum yoğunlaştırıcı kullanarak tüm DMSO'yu çıkarın. Alikotları -20 ºC'de ışıktan koruyarak saklayın. Alexa Fluor 405 için ultra saf H2O, alikot yapmak için uygun çözücüdür.</li>
	<li>Etiketleme reaksiyonunu gerçekleştirmek için, floroforun bir alikotunu 1-10 μL DMSO'da (veya Alexa Fluor 405 için ultra saf H2O) çözün. NOT: DMSO'nun kesin miktarı, önceki kontrol konjugasyon testleri ile belirlenir. Bu testler, yeni bir florofor partisi kullanılacağı zaman (veya önceki bir florofor partisi tükendiğinde) veya konjugasyonda ilk kez yeni bir florofor kullanıldığında gerçekleştirilir. Kontrol konjugasyon testi, konjugattaki optimal florofor-antikor oranını belirlemek için değişen miktarlarda florofor ile etiketleme reaksiyonlarının gerçekleştirilmesini içerir. Bizim durumumuzda, optimal oran tipik olarak 3 μL ile 5 μL arasındadır.</li>
	<li>50 μL ikincil IgG (veya birincil), 6 μL 1 MNaHCO3 ve 1-5 μL floroforu ışıktan korunarak oda sıcaklığında (RT) oda sıcaklığında (RT) 40 dakika inkübe edin.</li>
	<li>Reaksiyon ilerlerken, kapaklarını çıkararak ve tamponun geçmesine izin vererek saflaştırma boyutu dışlama kolonlarını hazırlayın. Sütun boyunca 3 x 2-3 mL PBS geçirerek sütunu dengeleyin (her etiketleme reaksiyonu için bir tane). Son dengeleme adımının inkübasyon sona ermeden önce bitmesi durumunda, kurumasını önlemek için kapakları geri takın ve etiketleme reaksiyonu bitene kadar bekleyin. NOT: Saflaştırma boyutu dışlama kolonları yerçekimi ile çalışır. Kolonun herhangi bir anda kurumadığından emin olun, aksi takdirde arıtma reaksiyonu düzgün çalışmayacaktır.</li>
	<li>Reaksiyon bittiğinde (adım 1.3), hacmi yaklaşık 200 μL yapmak için etiketleme reaksiyonuna 140 μL PBS ekleyin ve girdaplayın. Bu çözeltiyi sütunun ortasına ekleyin, numunenin sütuna girmesine izin verin ve son damla ayrıldıktan sonra 550 μL PBS ekleyerek itin. Sıvı düşmeyi bıraktığında, 300 μL PBS ekleyerek elüte edin ve 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünde toplayın.</li>
	<li>Numunenin 280 nm'de absorbansını ve kullanılan floroforların absorbansını ölçerek antikor konsantrasyonunu ve etiketleme oranlarını hesaplayın. Konsantrasyonu (molarite cinsinden) belirlemek için Beer-Lambert Yasasını aşağıdaki gibi uygulayın: 
	<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq1.jpg" style="opacity: 0.9;"> A, absorbansı temsil ederken, ε molar sönme katsayısını temsil eder ve CF280 , spesifik floroforun 280 nm'de sahip olduğu ve bir düzeltme faktörü olarak hizmet eden absorbansın bir ölçüsüdür. Daha sonra, antikorun konsantrasyonu: 
	<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq2.jpg" style="opacity: 0.9;"> Ve etiketleme oranı: 
	<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq3.jpg"></li>
	<li>Etiketli antikorları 4 ºC'de, ışıktan koruyarak 6 aya kadar saklayın.</li>
</ol>
2. İmmünofloresan etiketleme
<ol>
	<li>Organoidleri RT'de %4 paraformaldehit (PFA) ile 45 dakika sabitleyin. NOT: İSTEĞE BAĞLI: Antijenlerin immünoreaktivitesini arttırmak için organoidleri bir antijen alma solüsyonu (adım 2.2 ve 2.3) ile inkübe edin.</li>
	<li>0.117 mg sodyum sitrat tribazik dihidratı ultra safH2Oiçinde karıştırarak 40 mL antijen alma çözeltisi hazırlayın ve pH 9'a ayarlayın.</li>
	<li>Organoidleri, 1 saat boyunca 60 ° C'de hafif çalkalama (30 rpm) ile antijen alma çözeltisi ile inkübe edin.</li>
	<li>Organoidleri PBST (% 1 Triton X-100 ile PBS) ile RT'de 4 saat boyunca hafif çalkalama ile geçirgenleştirin.</li>
	<li>Organoidleri gece boyunca (veya 1 günden fazla) RT'de bloke edici solüsyon (% 0.1 Triton X-100 ile% 2 sığır serum albümini (BSA)) ile bloke edin. NOT: Primer ve sekonder antikor konsantrasyonları, belirli antikora bağlıdır. Tam montajlı numunelerin immünofloresanı için, kesitli numunelere kıyasla daha yüksek bir konsantrasyon kullanıyoruz. Primer antikoru 10 μg/mL'de inkübe ediyoruz, bu da çoğu durumda stoktan 1:100'e karşılık gelir (Tablo 1). Özel yapım sekonder antikorlarımızı 20-50 μg/mL'de inkübe ediyoruz.</li>
	<li>Organoidleri, yıkama çözeltisinde (% 0.1 Triton X-100 ile% 0.1 BSA) seyreltilmiş birincil antikorlarla 4 ° C'de 2 gün boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.</li>
	<li>Organoidleri 3 x 15 dakika boyunca RT'de hafif çalkalayarak yıkama solüsyonunda yıkayın.</li>
	<li>Organoidleri, yıkama solüsyonunda 4 ° C'de seyreltilmiş ikincil antikorlarla 2 gün boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.</li>
	<li>Organoidleri 3 x 15 dakika boyunca RT'de hafif çalkalayarak yıkama solüsyonunda yıkayın. NOT: İmmünoetiketlemeden sonra, tercih edilen floresan boyalar inkübe edilebilir. Normalde aktin filament ağını görselleştirmek için DAPI (1:1,000) ve DRAQ5 (1:500) veya phalloidin (1:100) gibi floresan çekirdek belirteçleri kullanırız.</li>
	<li>Organoidleri, RT'de yıkama çözeltisinde seyreltilmiş floresan boyalarla 1 saat boyunca hafif çalkalama ile inkübe edin.</li>
	<li>Organoidleri 3 x 15 dakika boyunca RT'de hafif çalkalayarak yıkama solüsyonunda yıkayın.</li>
</ol>
3. FluoClear BABB ile optik temizleme
NOT: 1-Propanol, özellikle uzun süreli maruz kalma için plastik kapları tehlikeye atabilir. Güvende olmak için cam kaplar kullanın.
<ol>
	<li>Dehidrasyon adımı<ol>
		<li> </li><li><li></ol></li><li> <ol><li><li><li> </li><li></ol></li></ol><ol><li> </li><li> </li></ol><ol><li><ol><li> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq4.jpg"> <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/68384/68384eq5.jpg" style="opacity: 0.9;"></li><li></li></ol></li><li><ol><li></li><li></li></ol></li><li><ol><li><li></li><li></li></ol></li></ol>

<ol><li>Lee, Y. J., Jo, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids+from+induced+pluripotent+stem+cells+of+patients+with+inherited+retinal+diseases%3A+A+systematic+review%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev+Rep%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids from induced pluripotent stem cells of patients with inherited retinal diseases: A systematic review.</a> Stem Cell Rev Rep. 21 (1), 167-197 (2025).</li>
<li>Onyak, J. R., Vergara, M. N., Renna, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoid+light+responsivity%3A+Current+status+and+future+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Res%22%5BJournal%5D)">Retinal organoid light responsivity: Current status and future opportunities.</a> Trans Res. 250, 98-111 (2022).</li>
<li>O’Hara-Wright, M., Gonzalez-Cordero, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+organoids%3A+A+window+into+human+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinal organoids: A window into human retinal development.</a> Development. 147 (24), dev189746(2020).</li>
<li>Wahle, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+spatiotemporal+phenotyping+of+human+retinal+organoid+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multimodal spatiotemporal phenotyping of human retinal organoid development.</a> Nat Biotechnol. 41 (12), 1765-1775 (2023).</li>
<li>Isla-Magrané, H., Veiga, A., García-Arumí, J., Duarri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiocular+organoids+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+displayed+retinal%2C+corneal%2C+and+retinal+pigment+epithelium+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Multiocular organoids from human induced pluripotent stem cells displayed retinal, corneal, and retinal pigment epithelium lineages.</a> Stem Cell Res Ther. 12 (1), 581(2021).</li>
<li>Isla-Magrané, H., Zufiaurre-Seijo, M., García-Arumí, J., Duarri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All-trans+retinoic+acid+modulates+pigmentation%2C+neuroretinal+maturation%2C+and+corneal+transparency+in+human+multiocular+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">All-trans retinoic acid modulates pigmentation, neuroretinal maturation, and corneal transparency in human multiocular organoids.</a> Stem Cell Res Ther. 13 (1), 376(2022).</li>
<li>Avilov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigating+across+multi-dimensional+space+of+tissue+clearing+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Appl+Fluoresc%22%5BJournal%5D)">Navigating across multi-dimensional space of tissue clearing parameters.</a> Methods Appl Fluoresc. 9 (2), 022001(2021).</li>
<li>Brenna, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+tissue+clearing+associated+with+3D+imaging%3A+application+in+preclinical+and+clinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Optical tissue clearing associated with 3D imaging: application in preclinical and clinical studies.</a> Histochem Cell Biol. 157 (5), 497(2022).</li>
<li>Bálint, Š, Verdeny Vilanova, I., Sandoval Álvarez, Á, Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlative+live-cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Correlative live-cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (9), 3375-3380 (2013).</li>
<li>Schwarz, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent-protein+stabilization+and+high-resolution+imaging+of+cleared%2C+intact+mouse+brains%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains.</a> PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).</li>
<li>Klingberg, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fully+automated+evaluation+of+total+glomerular+number+and+capillary+tuft+size+in+nephritic+kidneys+using+lightsheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Fully automated evaluation of total glomerular number and capillary tuft size in nephritic kidneys using lightsheet microscopy.</a> J Am Soc Nephrol. 28 (2), 452-459 (2017).</li>
<li>Dekkers, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+3D+imaging+of+fixed+and+cleared+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution 3D imaging of fixed and cleared organoids.</a> Nat Protoc. 14 (6), 1756-1771 (2019).</li>
<li>Wang, Y., Zhang, D. -H., Zhang, J. -Y., Chen, N., Zhi, G. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+synthesis+of+bioactive+ethyl+cinnamate+by+enzymatic+esterification+of+cinnamic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">High-yield synthesis of bioactive ethyl cinnamate by enzymatic esterification of cinnamic acid.</a> Food Chem. 190, 629-633 (2016).</li>
<li>Schellinger, A. P., Carr, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solubility+of+buffers+in+aqueous-organic+eluents+for+reversed-phase+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22LCGC+North+America%22%5BJournal%5D)">Solubility of buffers in aqueous-organic eluents for reversed-phase liquid chromatography.</a> LCGC North America. 22 (6), 544(2004).</li>
<li>Jiang, S. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B2-III-Tubulin%3A+A+reliable+marker+for+retinal+ganglion+cell+labeling+in+experimental+models+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">β-III-Tubulin: A reliable marker for retinal ganglion cell labeling in experimental models of glaucoma.</a> Int J Ophthalmol. 8 (4), 643-652 (2015).</li>
<li>Guo, J., Walss‐Bass, C., Ludueña, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%CE%B2+isotypes+of+tubulin+in+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The β isotypes of tubulin in neuronal differentiation.</a> Cytoskeleton. 67 (7), 431-441 (2010).</li>
<li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TuJ1+%28class+III+%CE%B2-tubulin%29+expression+suggests+dynamic+redistribution+of+follicular+dendritic+cells+in+lymphoid+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TuJ1 (class III β-tubulin) expression suggests dynamic redistribution of follicular dendritic cells in lymphoid tissue.</a> Eur J Cell Biol. 84 (2-3), 453-459 (2005).</li>
<li>Fernando, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+brain+and+retinal+organoids+from+confluent+cultures+of+pluripotent+stem+cells+connected+by+nerve-like+axonal+projections+of+optic+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Differentiation of brain and retinal organoids from confluent cultures of pluripotent stem cells connected by nerve-like axonal projections of optic origin.</a> Stem Cell Rep. 17 (6), 1476-1492 (2022).</li>
<li>Belecky-Adams, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax-6%2C+Prox+1%2C+and+Chx10+homeobox+gene+expression+correlates+with+phenotypic+fate+of+retinal+precursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Pax-6, Prox 1, and Chx10 homeobox gene expression correlates with phenotypic fate of retinal precursor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 38 (7), 1293-1303 (1997).</li>
<li>Rowan, S., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+the+homeodomain+transcription+factor+Chx10+in+the+retina+using+a+novel+multifunctional+BAC+transgenic+mouse+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of the homeodomain transcription factor Chx10 in the retina using a novel multifunctional BAC transgenic mouse reporter.</a> Dev Biol. 271 (2), 388-402 (2004).</li>
<li>Andilla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+tissue-mimic+with+light+sheet+microscopy%3A+A+comparative+guideline%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Imaging tissue-mimic with light sheet microscopy: A comparative guideline.</a> Sci Rep. 7, 44939(2017).</li>
<li>Olarte, O. E., Andilla, J., Gualda, E. J., Loza-Alvarez, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+microscopy%3A+A+tutorial%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Opt+Photonics%22%5BJournal%5D)">Light-sheet microscopy: A tutorial.</a> Adv Opt Photonics. 10, 111(2018).</li>
<li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li>
<li>Darche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+sheet+fluorescence+microscopy+of+cleared+human+eyes%5BTitle%5D)+AND+%22Commun+Biol%22%5BJournal%5D)">Light sheet fluorescence microscopy of cleared human eyes.</a> Commun Biol. 6 (1), 1025(2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>10x NA0.40 KURU objektif</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>63x NA1.40 YAĞ HEDEFİ</td><td>Leica</td><td>HC PL APO CS2</td><td>-</td></tr><tr><td>anti-GFP antikoru</td><td>Abcam</td><td>AB13970</td><td>-</td></tr><tr><td>Benzil alkol (BA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>13162</td><td>-</td></tr><tr><td>Benzil benzoat (BB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W213802</td><td>-</td></tr><tr><td>alttan camlı petri kabı</td><td>MatTek</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>-</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030 Serisi</td><td>-</td></tr><tr><td>Chx10 antikoru</td><td>Sta Cruz Biyoteknoloji</td><td>SC-365519 (İngilizce)</td><td>-</td></tr><tr><td>Cytiva Illustra Nap-5 jel filtrasyon kolonları, Sephadex G-25</td><td>Sigma Aldrich</td><td>17-0853-02</td><td>-</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542 Serisi</td><td>-</td></tr><tr><td>DMSO'nun</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8418 Serisi</td><td>-</td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Termo Balıkçı</td><td>62251</td><td>-</td></tr><tr><td>Boya (karboksilik asit, süksinimidil ester)</td><td>Invitrogen veya Abberior</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji&nbsp;</td><td>NIH</td><td>&nbsp; v1.50i</td><td>-</td></tr><tr><td>Ters konfokal lazer tarama mikroskobu</td><td>Leica mikro sistemleri</td><td>TCS SP8 STED 3X-FALCON</td><td>-</td></tr><tr><td>LAS X 3D işleme yazılımı</td><td>Leica mikro sistemleri</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>mQ H2O</td><td>-</td><td>-</td><td>Synergy su arıtma sisteminden ultra saf su</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Acros Organik</td><td>424270010</td><td>-</td></tr><tr><td>Etiketlenmemiş ikincil IgG</td><td>Jackson İmmünoaraştırma</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Opsin mavisi antikoru</td><td>Millipore&nbsp; &nbsp;</td><td>AB5407&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Opsin RG antikoru</td><td>Kırlangıç</td><td>AB5745&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Paraformaldehit (PFA) %4</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>J199943-K2</td><td>-</td></tr><tr><td>PBS Çözümü</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td>-</td></tr><tr><td>Falloidin etiketleme probları</td><td>Termo Balıkçı</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>10010023</td><td>-</td></tr><tr><td>RECOV antikoru</td><td>Kırlangıç</td><td>AB5585-I&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>RHO (RET-P1) antikoru</td><td>Sigma Aldrich</td><td>O4886&nbsp;</td><td>-</td></tr><tr><td>Sodyum sitrat tribazik dihidrat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8532</td><td>-</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787</td><td>-</td></tr><tr><td>TUJ1 antikoru</td><td>Covance&nbsp;</td><td>MMS-435P&nbsp;</td><td>-</td></tr></tbody></table>

hücresel Çözünürlük ile tam montajlı retinal organoid görselleştirme

Whole-mount Retinal Organoid Visualization with Cellular Resolution

Hücresel Çözünürlük ile Tam Montajlı Retinal Organoid Görselleştirme

Retinal organoids derived from human induced pluripotent stem cells are intricate 3D structures that mimic the human retina, offering a powerful platform ...

whole-mount-retinal-organoid-visualization-with-cellular-resolution

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video makale Organotipik retina wholemount kültürler ve eksojen kaynaklı etkileri analizi için bir sitospin prosedürü kurulması göstermektedir. Organotipik retina wholemount kültürleri...

Organotipik murin Retina Wholemount Kültür in vivo

Organoidlerin tüm 3Boyutlu yapısı ve hücresel içeriği nin yanı sıra orijinal dokuya olan henotipik benzerlikleri burada açıklanan tek hücreli çözünürlükte 3D görüntüleme protokolü kullanılarak yakalanabilir. Bu protokol, kökeni, büyüklüğü ve şekli değişen çok çeşitli organoidlere uygulanabilir.

Bozulmamış Organoidlerin Tek Hücreli Çözünürlükte Üç Boyutlu Görüntülemesi

Burada, insan pluripotent kök hücresi (hPSC) kaynaklı retinal dokunun büyük bir hayvan modelinin subretinal boşluğuna nakledilmesi için cerrahi bir teknik sunulmaktadır.

Bir Kedi Büyük Hayvan Modelinde İnsan Embriyonik Kök Hücre Kaynaklı Retinal Dokunun Subretinal Transplantasyonu

Bu çalışma, eksplant kullanımı sırasında retina bütünlüğünü tehlikeye atmayı önleyen yeni bir insan organotipik retina kültürü (HORC) modeli geliştirmeyi amaçlamaktadır. Bu, retinanın aşırı vitreus ve alttaki retina pigment epitel-koroid (RPE-choroid) ve sklera ile kültleşmesi ile elde edilir.

Yeni bir İnsan Organotipik Retina Kültürü Tekniğinin Karakterizasyonu

Kendi kendini organize eden bir yöntem kullanarak, fotoreseptörlerin oluşumunu önemli ölçüde artırabilecek COCO ilavesiyle bir protokol geliştiriyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden Retinal Organoidlerin Yönlendirilmiş İndüksiyonu

Burada, çeşitli insan pluripotent kök hücre hatlarının yüksek tekrarlanabilirlik ve verimlilikle retina dokuları üretmesi için uygun olan optimize edilmiş bir retinal organoid indüksiyon sistemini açıklıyoruz.

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden 3D Retinal Dokuların Türetilmesi için Retinal Organoid İndüksiyon Sistemi

Bu protokol, hiPSC'leri göz alanı kümelerine ayırmanın ve hem yapışkan hem de süspansiyon kültür sistemlerini içeren basitleştirilmiş kültür koşullarını kullanarak nöro-retinal organoidler üretmenin etkili bir yöntemini açıklamaktadır. RPE ve kornea epiteli gibi diğer oküler hücre tipleri de retina kültürlerinde olgun göz alanlarından izole edilebilir.

Sağlıklı ve Retina Hastalığına Özgü İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Retinal Organoidlerin Üretimi

Bu protokol, transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid numuneler için optimize edilmiş ve ayrıntılı bir hazırlık prosedürü sağlar. Olgun retinal organoidlerde sinapsların analizini içeren uygulamalar için uygundur.

Transmisyon elektron mikroskobu için retinal organoid örneklerinin hazırlanması

Mikroglia, retinada bulunan benzersiz yerleşik bağışıklık hücreleridir ve çeşitli retinal dejeneratif hastalıklarda çok önemli roller oynar. Retinal organoidlerin mikroglia ile ko-kültür modelinin oluşturulması, retina hastalıklarının patogenezinin ve gelişim sürecinin daha iyi anlaşılmasını kolaylaştırabilir.

Retinal Organoidlerin Mikroglia ile Birleştirilmesi

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Keşfedin optik temizleme ve immünolabeling ile tam montajlı retinal organoid görüntüleme yöntemini. Bu teknik, konfokal mikroskopi kullanarak 3D hücresel çözünürlükte retinal gelişimi ve hastalık mekanizmalarını detaylı şekilde incelemenizi sağlar.

Hücresel Çözünürlük ile Tam Montajlı Retinal Organoid Görselleştirme

Daha fazla video keşfet