Fare Namlu Koreksinde Sirkadiyen Sinaptik Plastisitenin Analizi için Görselleştirme Tekniği Olarak Transmisyon Elektron Mikroskobu

Nöral plastisiteyle, özellikle sinapsların, nöronların ve glial hücrelerin plastisitesindeki sirkadiyen değişikliklerle ilgileniyoruz. Sinapsların gece gündüz ve patolojik koşullar altında nasıl dönüştüğü sorusuna cevap vermeye çalışıyoruz. Çalışma alanımızdaki en son gelişmeler, gen ekspresyonu ile manipüle etmek için çeşitli genetik araçlar kullanmak, ayrıca beyindeki değişiklikleri görselleştirmek için yöntemler kullanmak ve ayrıca nörodejeneratif hastalıkları incelemek için artan sayıda hayvan modeli var. Elektron iletim mikroskobu kullanarak, farelerin namlu korteksindeki sinaps sayısının gündüz ve gece boyunca değiştiğini bulduk. Ve bu ritim, en azından inhibitör sinapslar durumunda da sirkadiyendir. Çünkü inhibitör sinapslar gece boyunca sayıları artarken, uyarıcı sinapslar gündüzleri artar. Meyve sineğinin beyninde de benzer değişiklikler bulduk. Bu türde sinaps sayısı da gece ve gündüz değişir. Ayrıca nöronların ve glial hücrelerin şeklinde yapısal değişiklikler bulduk.

[Anlatıcı] Başlamak için farenin beyinciğini alın ve beyni iki yarım küreye bölün. Bir yarım küre seçin ve bölümler namlu korteksine teğet olarak kesilebilecek şekilde yönlendirin. Daha sonra kesitleri 60 mikrometre kalınlığında kesin ve bire beş oranında 0,1 molar fosfat tamponu ve fiksatif içeren bir çözeltiye aktarın. Bölümleri ışık mikroskobu altında inceleyin ve yalnızca namlu alanı korteksi açıkça gösteren bölümleri toplayın. Bir boya fırçası kullanarak bölümleri yavaşça küçük bir cam Petri kabına aktarın. Beyin bölümlerini 0.1 molar kakodilat ile durulayın. Daha sonra, kesitleri %1 potasyum ferrisiyanür ile 0.1 molar kakodilat tamponunda %1.5 osmiyum tetroksit içinde sabitleyin. Kesitler damıtılmış suda durulandıktan sonra, 25 milimetre filtreli bir şırınga kullanarak %1 uranil asetat içeren %70 etanolü mendillerle birlikte her Petri kabına yavaşça dağıtın. Dört santigrat derecede %70 etanol içinde gece boyunca inkübasyondan sonra, dokuları %80, %90 ve %100 etanol içinde yıkayın. Daha sonra dokuları propilen oksit içinde iki kez 10'ar dakika yıkayın. Daha sonra propilen oksidi iki mililitre bire bir Poli/Yataklı reçine ve propilen oksit karışımıyla değiştirin. Bir kapakla örtün ve 40 dakika inkübe edin. Beyin bölümlerini iki mililitre üçe bir Poli/Yatak reçinesi ve propilen oksit karışımına gömün. Örtün ve 1,5 saat bekletin. Ardından, ACLAR filmini standart bir cam slayt boyutuna uygun parçalara ayırın. Plastik bir pipet kullanarak, her bir ACLAR film parçasına az miktarda reçine uygulayın. Bir boya fırçası ile beyin bölümlerini Petri kabından ACLAR film üzerindeki reçineye aktarın. Her bölümü iki ACLAR filmi arasına gömün ve polimerize etmek için inkübe edin. İki kat objektifli bir ışık mikroskobu kullanarak, gömülü beyin bölümlerini fotoğraflayın. Görüntüleri açmak için Dosya ve Aç'ı tıklatın, Shift tuşunu basılı tutarken görüntüleri seçin ve Aç'ı tıklatın. Korteksten görüntüleri istiflemeye başlayın. Her görüntüde Katman 1'e sağ tıklayın, Katmanı Çoğalt'ı seçin ve diyalog kutusuna ad olarak görüntü numarasını girin. Hedef dosya olarak bir görüntü seçin ve Tamam'ı tıklatın. Ardından, görüntüleri manuel olarak hizalamak için Taşıma aracını kullanın ve gerektiği gibi Düzenle, Dönüştür, Döndür veya Çevir ile yönlendirmeyi ayarlayın. Daha ince ayarlamalar için Düzenle, Dönüştür, Deforme Et'i kullanın ve anatomik işaretlerle eşleşecek şekilde köşeleri ayrı ayrı hareket ettirin. Hizalamayı kolaylaştırmak için üst katmanın karıştırma modunu Katmanlar panelinde üst katmana ayarlayın. Namlu korteksini gösteren her bölümde, seçilen namluyu tanımlamak için bir stereo mikroskop kullanın ve bir tıraş bıçağı kullanarak bitişik olanla birlikte kesin. Kesiti reçine bloğa gömdükten sonra, ultra ince kesitleri Formvar kaplı tek yuvalı nikel ızgaralar üzerinde toplayın. TEM görüntü yığınını daha önce gösterildiği gibi hizaladıktan sonra analiz alanını tanımlayın. Katman'a, ardından Yeni ve Katman'a tıklayın, ardından Tamam'a tıklayın. Dikdörtgen aracını seçin, Katman, Katman Stili, Kontur'a gidin. Kontur rengini, kalınlığını ve konumunu içe ayarlayın, ardından Tamam'ı tıklatın. Şimdi, analiz sınırını tanımlamak için bir dikdörtgen çizin ve %0'ı doldur'u seçin. Ek açıklamalar için yeni bir katman eklemek üzere Katman, Yeni, Katman'ı seçin ve ardından Tamam'ı tıklatın. Bu katmandaki sinapsları işaretlemek için Fırça aracını kullanın. Açıklama eklerken hassasiyeti sağlamak için Yakınlaştırma aracını ve El aracını kullanın. Şimdi, 3D yeniden yapılandırma için tasarlanan görüntü yığınını açın. Kırpma aracını seçin, yığın boyunca dendritik omurgayı içeren bölgeyi işaretleyin ve bu bölgeyi tüm görünür katmanlarda kırpmak için Enter tuşuna basın. Bir kerede yalnızca bir katmanı görünür yapmak için, Katmanlar panelindeki göz simgesini değiştirin. Dosya, Farklı Kaydet'e tıklayın, dosyayı adlandırın, JPG formatını seçin ve kırpılan her görüntüyü ayrı ayrı kaydetmek için Tamam'a tıklayın. 3D yeniden yapılandırma yazılımını açın. Yüklemeden önce, görünüm alanı perspektifini hizalamak için gezinme aygıtında Z'ye tıklayın veya sayısal tuş takımı 7'ye basın. Ardından, resimleri yüklemek için Ekle, Resim, Referans'a tıklayın, ardından ilk resmi seçin ve onaylamak için çift tıklayın. Son TEM görüntüsünü z ekseni boyunca konumlandırmak için görüntüye tıklayın. Sağ kenar çubuğundaki Nesne Özellikleri panelinde, Konum Z alanına uygun değeri girin. Tüm görüntüleri z ekseni boyunca eşit olarak dağıtmak için tüm görüntü nesnelerini seçin. Bitiş panelini açmak için End (Son) düğmesine basın. Düzenle sekmesine gidin ve kesit kalınlığına göre otomatik olarak boşluk bırakmak için Z'yi Dağıt'a tıklayın. Görüntü başına tek bir eğri kullanarak her TEM görüntüsündeki dendritik omurga şeklini manuel olarak özetlemek için Ekle, Eğri ve Daire'yi tıklatın. Daireyi taşımak için g tuşunu basılı tutun, fareyi sürükleyin ve ardından yerleşimi onaylamak için tıklayın. Büyüklüğü ayarlamak için s tuşunu basılı tutun, sonra onaylamak için tıklayın. Ardından, nesneyi dendritik omurganın şekliyle hizalanacak şekilde ölçeklendirin. Şimdi kavisli şekli omurga sınırına uyacak şekilde değiştirin. Bir kontrol noktası seçin, g tuşuna basın, noktayı taşıyın ve onaylamak için tıklayın. Tutamaç noktalarını ayarlamak, eğrinin yönünü ve yoğunluğunu iyileştirmek için gerektiği gibi g veya s tuşlarını kullanın. Daha fazla ayrıntı eklemek için Shift tuşunu basılı tutun ve iki komşu denetim noktası seçin. Ardından sağ tıklayın ve aralarına yeni bir nokta eklemek için Alt Böl'ü seçin. Eğri omurganın ana hatlarını doğru bir şekilde çizdikten sonra, Düzen sekmesine girin, Bezier daire nesnesine sağ tıklayın ve fareyi hareket ettirmeden Nesneyi Çoğalt'ı seçin. Birleştirilen nesnenin kenarlarını birleştirmek ve kapalı bir ağ oluşturmak için Modelleme sekmesine girin. Kenar Seçim Moduna geçmek için 2 basın. Seç, Tümü'ne tıklayın, sağ tıklayın ve kenar halkalarını birbirine bağlamak için Kenar Döngülerini Köprüle'yi seçin. Nesnenin üst kısmındaki boşluğu doldurmak için, yanındaki simgesine tıklayarak tümünün seçimini kaldırın. Alt tuşunu basılı tutun ve tüm döngüyü seçmek için üst çıkıntının bir kenarına tıklayın. Sağ tıklayın ve Kenarları Yükselt'i seçin, z ekseni boyunca yukarı doğru sürükleyin. Şimdi s tuşuna basın, yeni döngüyü küçültmek için fareyi içeri doğru hareket ettirin ve onaylamak için tıklayın. Döngü hala seçiliyken, sağ tıklayın ve Kenarlardan Yeni Yüz'ü seçin. Son yapıyı düzeltmek için sağ kenar çubuğundaki Değiştiriciler sekmesine gidin. Değiştirici Ekle'ye tıklayın, Oluştur'a gidin ve Alt Bölüm Yüzeyi'ni seçin. Tutarlı yumuşatma için görünüm alanını ve işleme düzeylerini bir olarak ayarlayın. Tek tek yapılara renk atamak için istediğiniz nesneyi seçin. Aç Malzeme sağ kenar çubuğundaki sekmeyi tıklayın, Yeni'ye tıklayın ve temel rengi ayarlayın. Sahne aydınlatmasını ayarlamak için ışık nesnesini seçin. g düğmesini basılı tutun, ışığı yeniden konumlandırmak için fareyi hareket ettirin ve yeni konumunu onaylamak için tıklayın. Kamerayı işleme için konumlandırmak için, görüntü alanını son çıktıda görünmesi gerektiği gibi dendritik omurgaya bakacak şekilde yönlendirin. Fotoğraf makinesini geçerli görünüme tutturmak için Control + Alt + sayısal tuş takımı 0 tuşlarına basın. Kamera çerçevesini seçerek, g tuşunu basılı tutarak ve çerçeveyi iyileştirmek için hareket ettirerek ayarlayın. Fare somatosensoriyel korteksi, boyanmamış beyin bölümlerinde bile tanımlanabilirdi ve tek tek varillerin birden fazla bölüme dağılmasına rağmen, tüm namlu alanı dijital araçlar kullanılarak yeniden yapılandırılabilirdi. Ardışık ultra ince TEM görüntüleri, sinapsların seri görsel kanıtlara dayalı olarak uyarıcı veya engelleyici tiplere güvenilir bir şekilde sınıflandırılmasını sağladı. Dendritik dikenlerin seri kesitlerden üç boyutlu rekonstrüksiyonu, omurga morfolojisinin görselleştirilmesine izin vererek ince, mantar, güdük dikenler ve orta gibi farklı şekilleri ortaya çıkardı. Omurga şekilleri, omurga uzunluğu, boyun uzunluğu ve omurga, baş ve boyun çapları dahil olmak üzere ölçümlere dayalı olarak ölçüldü.