Viral Yaşam Döngülerini In Vitro Araştırmak için SARS-CoV-2 Virüsü Benzeri Bir Parçacık Sisteminin Üretimi

Gerçek virüsü yakından taklit eden SARS-CoV-2 virüsü benzeri parçacıklar üretmek için optimize edilmiş bir in vitro protokol sunuyoruz. Bu yaklaşım, bir biyogüvenlik seviye 3 laboratuvarı gerektirme kısıtlamaları olmadan viral enfeksiyon, montaj ve çıkış mekanizmalarının araştırılmasını sağlar.

Araştırmamız, SARS-CoV-2 virüsünün biyolojisini anlamaya ve özellikle Çin tıbbından SARS-CoV-2'ye karşı ilaç bulmaya odaklanmıştır. Tüm canlı SARS-CoV-2 virüs çalışmaları, biyogüvenlik seviyesi üç laboratuvarda kontrol edilmelidir. Ve bu deneysel sınırlama, bir SARS-CoV-2 çalışmasını yalnızca bir avuç yaşamda uygulanabilir hale getiriyor. SARS-CoV-2 virüsü benzeri pratik bir yöntem olan SARS-CoV-2 ile ilgili çalışmanın biyogüvenlik seviye üç laboratuvar sınırlaması olmaksızın mümkün olması ve liste oldukça faydalı bir yöntem olacaktır.

[Öğretim Görevlisi] Başlamak için, yaklaşık 3 milyon HEK-293T hücresini, %10 FBS ve %1 penisilin-streptomisin ile desteklenmiş DMEM tam ortamlı 10 santimetre çapında bir doku kültürü plakasında tohumlayın. Hücreleri yaklaşık 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte kültürleyin. Mikroskop altında hücre koakıcılığını kontrol edin. 60 mikrolitre PEI'yi mililitre başına bir miligram stok çözeltisinden serum içermeyen bir ortamla seyreltin ve 200 mikrolitrelik bir nihai hacme ulaşın. Şimdi, 200 mikrolitre serumsuz ortam alın ve içine 6.7 mikrogram N plazmid, 10 mikrogram Luc-T20 plazmit, 0.016 mikrogram S plazmidi ve 3.3 mikrogram M-IRES-E plazmidi ekleyin. Seyreltilmiş PEI çözeltisini, viral yapı proteinleri için kaplama içeren plazmid içeren çözeltiye yavaşça ekleyin ve karışımı oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Bu transfeksiyon çözümüdür. Transfeksiyon solüsyonunu HEK-293T hücrelerinin üzerine dikkatlice bırakın ve iyice karıştırmayı sağlamak için doku kültürü plakasını hafifçe döndürün. Hücre kültürü ortamını enfeksiyondan altı saat sonra DMEM tam ortamı ile değiştirin ve transfekte edilmiş HEK-293T hücrelerini 48 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede inkübe edin. SARS-CoV-293 virüsü benzeri parçacıkları içeren enfekte HEK-2T hücrelerinin süpernatantını toplayın. Hücresel kalıntıları gidermek için toplanan süpernatanı 0.45 mikrometrelik bir şırınga filtresinden süzün. Bu SC2-VLP ortamıdır. Anjiyotensin Dönüştürücü Enzim 2 veya ACE2'nin kararlı ekspresyonu ile 40.000 HEK-293T hücresi tohumlayın ve 96 oyuklu bir plakaya TMPRSS2 ve 50 mikrolitre SC2-VLP ortamı ekleyin. 96 oyuklu doku kültürü plakasını 37 santigrat derecede %5 karbondioksit ile 24 saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, ortamı 96 oyuklu plakanın her bir oyuğundan çıkarın ve bir kez 37 santigrat dereceye kadar ısıtılmış 100 mikrolitre PBS ile yıkayın. ACE2 ile tohumlanmış HEK-293T hücrelerini 20 mikrolitre Pasif lizis tamponu ile TMPRSS2 hücreleri parçalayın ve numuneyi oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir orbital çalkalayıcı üzerinde hafifçe sallayın. 96 oyuklu plakayı, soğutulmuş bir mikroplaka santrifüjü kullanarak dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 4.000 G'de döndürün ve ardından plakayı hemen bir buz banyosuna aktarın. 100 mikrolitre sulandırılmış lusiferaz tahlil tamponunu yeni bir opak beyaz 96 oyuklu plakaya alın ve her oyuğa 20 mikrolitre lizat ekleyin. İki ila üç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek kısa bir süre karıştırın. Bir plaka okuyucu kullanarak lüminesans sinyalini ölçün. Daha sonra, SC2-VLP ortamının bileşimini değerlendirmek için, 10 mililitre SC2-VLP ortamına 1.36 mililitre PEG 8000 çözeltisi ekleyin. Karışımı bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin ve gece boyunca dört santigrat derecede yavaşça karıştırın. Çözeltiyi dört santigrat derecede ve 2.000 G'de 30 dakika santrifüjleyin. Ve batı lekeleme analizi için SC2-VLP peletini toplayın. Yaklaşık 3 milyon HEK-293T hücresini, 15 milimetre çapında bir cam tabanlı kültür kabına eşit şekilde tohumlayın ve hücrelerin yaklaşık% 70 birleşmeye ulaşana kadar yapışmasına ve büyümesine izin verin. Modifiye edilmiş plazmit miktarları ile daha önce gösterildiği gibi hücreleri kestikten sonra, kültür kabını bir mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez nazikçe yıkayın. Oda sıcaklığında bir mililitre% 4 paraform aldehit fiksasyon çözeltisi ekleyin ve 15 dakika inkübe edin. Hücreleri oda sıcaklığında bir mililitre PBS ile her biri beş dakika boyunca iki kez yıkayın ve 10 dakika boyunca bir mililitre% 0.25 Triton X-100 ekleyerek hücrelere nüfuz edin. Yine, hücreleri oda sıcaklığında bir mililitre PBS ile her biri beş dakika boyunca iki kez yıkayın. Daha sonra, spesifik olmayan antikor etkileşimlerini bloke etmek için bir saat boyunca bir mililitre% 5 sığır serum albümini ekleyin. Cam tabanı kaplamak için yaklaşık 200 mikrolitre birincil antikor çözeltisi ekleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin. Daha sonra, birincil antikor çözeltisini çıkarın ve hücreleri oda sıcaklığında bir mililitre PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Şimdi, floresan konjuge bir ikincil antikor çözeltisi ekleyin ve oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. Hücreleri PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, çekirdekleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca mililitre Hoechst çözeltisi başına 2.5 mikrogram ile boyayın. Son olarak, hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, konfokal bir mikroskop kullanarak görüntü elde etmeden önce S proteini veya organel lekelenmesini gözlemleyin. Bu şekil, SC2-VLP üretiminin, spike proteinini kodlayan plazmitin değişen transfeksiyon miktarlarına duyarlılığını göstermektedir. SC2-VLP titresi, 0.016 mikrogram S plazmidi transfekte edildiğinde en yüksekti ve 0.16 ve 1.6 mikrogram S plazmidi ile önemli ölçüde azaldı. Spike proteinindeki H1271 ila E mutasyonu, vahşi tipe kıyasla SC2-VLP titresini önemli ölçüde azalttı. E1262 ila H mutasyonu, SC2-VLP titresinde orta derecede bir azalmaya yol açarken, E1262 ila H, H1271 ila E çift mutasyonu üretimi tamamen ortadan kaldırdı. Tam uzunlukta S ve S-2 protein bantları, vahşi tipe kıyasla E1262'de H ve çift mutant şeritlere düşürüldü. S paketleme verimliliği de E1262'de H'ye ve H1271'de E mutantlarına düşürüldü ve çift mutantta neredeyse ortadan kaldırıldı. VLP bolluğu, vahşi tip ve tüm S mutantları arasında büyük ölçüde değişmeden kaldı. Vahşi tip S proteini, cis-Golgi markörü GM130 ile kolokalize edilir, ancak ER markörü Sec61 beta veya ERGIC markörü ERGIC 53 ile kolokalize edilmez. H1271 ila E mutant S proteini, yaygın sitoplazmik dağılım gösterdi ve GM130 ile kolokalizasyondan yoksundu.