Name: Arabidopsis rozetleri kullanılarak yaprak yüzeyi ve apoplastik RNAnın izolasyonu ve analizi için aşamalı bir kılavuz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-08-08T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Öğrenin, Arabidopsis rozetlerinden yaprak yüzeyi ve apoplastik RNA izolasyonu yöntemini. Yüksek çözünürlüklü jel elektroforezi ve Illumina analizi ile biyotik strese yanıtı inceleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Tampon hazırlama ve sterilizasyon
<ol>
	<li>1 L damıtılmış suda 20 mM 2- (N-morfolino) etansülfonik asit (MES), pH 6.0, 2 mM CaCl2 ve 0.01 M NaCl içeren vezikül izolasyon tamponu (VIB) hazırlayın. NOT: Yaprak apoplastın iyonik konsantrasyonunu taklit etmek için VIB'deki NaCl konsantrasyonunda 0.1 M ila 0.01 M arasında küçük ayarlamalar yapılmıştır.</li>
	<li>VIB'yi 121 ° C'de, sıvı döngüsünde 20 dakika otoklavlayın. Alternatif olarak, 0,45 μm'lik bir vakum filtresi kullanarak VIB'yi filtreyle sterilize edin. NOT: Bu adım, herhangi bir mikrobiyal kontaminasyon bitkilerin ortaya çıkmasına ve dolayısıyla sonuçlarda değişkenliğe yol açabileceğinden, tamponun steril olmasını sağlamak içindir. Bu tampon, kısa süreli depolama için oda sıcaklığında (sterilizasyon sonrası kapağı açmadan) veya uzun süreli depolama için 4 °C'de saklanabilir.</li>
</ol>
2. Bitki materyali ve büyüme durumu
<ol>
	<li>Arabidopsis thaliana Col-0 yabani tip (WT) tohumları standart bir saksı karışımı içeren 4 inçlik yuvarlak plastik saksılara ekin. Ekimden sonra tohumları biyolojik bir mantar ilacı (600 mg/L) ile ıslatın, üzerini şeffaf plastik bir kubbe ile örtün ve senkronize çimlenmeyi sağlamak için 4 °C'de 3 gün karanlıkta tutun.</li>
	<li>Tohumlu saksıları, bitki düzeyinde 150 μmol·m−2·s−1 fotosentetik foton akı yoğunluğu ile 9 saat ışık/15 saat karanlık fotoperiyot altında 24 °C'ye ayarlanmış, sıcaklık kontrollü kısa günlük büyüme odasına aktarın (50:50 3.500 ve 5.000 K spektrumlu 32 watt floresan ampul karışımı).</li>
	<li>Yaklaşık 10 gün sonra, tek tek fideleri saksı karışımı içeren 36 hücreli tepsi eklerine aktarın ve 1-2 hafta boyunca şeffaf plastik bir kubbe ile örtün. NOT: Tipik bir deney, her genotip/tedavi için ~ 12-24 sağlıklı bitki gerektirir. 6-7 haftalık bitkilerin, en düşük hücresel kontaminasyon riski ile optimum miktarda LSW ve AWF RNA verdiği kaydedilmiştir.</li>
	<li>Kullanılan saksı karışımına bağlı olarak, kuraklık veya sel stresini önlemek için bitkileri her 10-15 günde bir sulayın.</li>
</ol>
3. Yaprak yüzeyi RNA'sının toplanması
<ol>
	<li>Santrifüj esaslı yöntem (Yaprak Yüzey Yıkama; LSW)<ol>
		<li>Her çoğaltma için 6-7 haftalık Arabidopsis bitkileri kullanın.</li>
		<li>LSW'nin izolasyonuna başlamadan önce% 0.001'lik bir nihai konsantrasyonda (100 mL VIB'de 1 μL) steril VIB'ye Silwet-L77 (bundan böyle ıslatıcı ajan olarak anılacaktır) ekleyin. NOT: Silwet-L77, yüzey gerilimini azaltan ve tamponun yaprak yüzeylerini kaplamasını sağlayan bir ıslatıcı maddedir.</li>
		<li>100 mL VIB'yi 500 mL'lik bir sprey şişesine aktarın.</li>
		<li>Arabidopsis rozetlerini ince makas kullanarak köklerinden dikkatlice ayırın.</li>
		<li>Yumuşak bir fırça kullanarak yaprak sapındaki fazla toprağı alın.</li>
		<li>Rozetleri, abaksiyal yüzeyi yukarı bakacak şekilde düz bir tepsiye yerleştirin.</li>
		<li>Sprey şişesinin beş pompasını kullanarak abaksiyal yüzeye VIB + ıslatıcı madde püskürtün.</li>
		<li>Rozetleri dikkatlice çevirin ve adaksiyal yüzeye beş kez VIB + ıslatıcı madde püskürtün.</li>
		<li>LSW'yi geri kazanmak için, püskürtülen rozetleri, 250 mL santrifüj şişelerinin içine yerleştirilmiş, altta delikli iğnesiz 60 mL şırıngaların içine dikkatlice yerleştirin (şırınga başına en fazla iki adet 6 haftalık rozet sığabilir). Şırınga ucunu şişenin dibinin üzerine asmak için şırıngayı boynun etrafına parafilm ile sarın (Referans için Şekil 1'e bakın). NOT: Delikli 60 mL şırıngaların hazırlanmasıyla ilgili ayrıntılar için daha önce yayınlanan protokol11'e bakın.</li>
		<li>Yüklü şişeleri 100 g'da 4 °C'de 10 dakika santrifüjleyin (JA-14 rotor).</li>
		<li>LSW'yi 0.22 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün ve süzüntüyü buz üzerine yerleştirilmiş 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. NOT: Tipik olarak, 12 tesis bu protokolü kullanarak sonunda yaklaşık 30 mL LSW verecektir. Ancak bu, her adımda gerçekleştirilen püskürtme sayısına dayalı bir tahmindir. Bu hacim normalde püskürtülen hacimden daha azdır, çünkü püskürtülen tamponun bir kısmı kullanım sırasında kaybolur.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Yaprak yüzey çubuğu (LSS) yöntemi<ol>
		<li>Ayrılmış rozetlere önceki bölümde açıklandığı gibi VIB + ıslatıcı madde püskürtün (adım 3.1.1-3.1.7).</li>
		<li>LSS'yi geri kazanmak için, steril pamuk uçlu çubuklar kullanarak adaksiyel ve abaksiyal yüzeyleri temizleyin ve sıvıyı sıkmak için ıslatılmış uçları 15 mL'lik bir santrifüj tüpünün iç duvarına bastırın. NOT: Abaksiyal ve abaksiyal LSS numuneleri, deney düzeneğine ve beklenen sonuca bağlı olarak ayrı tüplerde toplanabilir.</li>
		<li>LSS numunelerini 0.22 μm'lik bir şırınga filtresinden buz üzerine yerleştirilmiş 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün. NOT: Sürüntü alınan bitki sayısına bağlı olarak, deney başına değişen hacimlerde LSS toplanabilir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68406/68406fig1.jpg"> 
Şekil 1: Yaprak yüzeyi yıkama ve apoplastik yıkama sıvısı izolasyonu için kullanılan aletler. (A) LSW ve AWF'yi toplamak için, iki bütün Arabidopsis thaliana rozeti, yıkamanın akması için kanallar oluşturmak üzere ısıtılmış forseps ile şırınganın ucuna eritilen sekiz ek deliğe sahip 60 mL'lik bir şırıngaya yerleştirilir. (B) Bu iğnesiz şırınga daha sonra gösterildiği gibi boyun bölgesinde parafilm ile sarılır. (C) Bu adım, şırınganın şişenin dibine dokunmadan 250 mL'lik bir santrifüj şişesine sığmasını sağlar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68406/68406fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
4. Apoplastik yıkama sıvısının (AWF) toplanması
<ol>
	<li>LSW veya LSS izolasyonu için kullanılan aynı bitki setini bir behere yerleştirin ve damıtılmış su ile iki kez nazikçe durulayın.</li>
	<li>Rozetleri VIB ile 20 saniye boyunca aşağıdaki gibi vakumla sızdırın: NOT: Vakum sızma işlemi daha önce yayınlanmış bir protokol11'de iyi bir şekilde tanımlanmış olsa da, mevcut protokolü açıklığa kavuşturmak için burada yeniden üretilmiştir.<ol>
		<li>Rozetleri 300-500 mL VIB içeren bir French press kahve makinesine dikkatlice yerleştirin. Kapağı French press'in üzerine yerleştirin ve bitkiler tamamen suya batırana kadar pistonu yavaşça indirin.</li>
		<li>French press'i bitkilerle birlikte yerleştirin ve bir vakum odasına tamponlayın. Bir vakum pompası kullanarak 20 saniye boyunca vakum uygulayın. Tampon kaynamaya başlamalıdır.</li>
		<li>Vakumu serbest bırakın ve French press'i vakum odasından çıkarın, kapağı çıkarın ve VIB'yi ayrı bir 500 mL plastik kabın içine dökün. French press'ten rozetleri çıkarın. NOT: VIB, bir genotip için aynı gün içinde birden çok kez yeniden kullanılabilir, ancak bir kez vakum sızması için kullanıldığında, VIB başka bir gün kullanılmak üzere saklanmamalıdır.</li>
		<li>Yaprakları bir kağıt havlu üzerinde hafifçe sallayarak ve ardından fırçalayarak bitkilerdeki fazla VIB'yi çıkarın.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kurutma kağıdı ile nazikçe lekeleyerek yaprak yüzeylerindeki fazla tamponu çıkarın.</li>
	<li>Apoplastik yıkama sıvısını (AWF) toplamak için, rozetleri LSW toplama için tarif edildiği gibi 250 mL santrifüj şişelerinin içine yerleştirilmiş 60 mL iğnesiz şırıngaların içine yerleştirin ve yavaş ivmelenme ile 600 × g'da 30 dakika boyunca 4 °C'de santrifüjleyin.</li>
	<li>Havuzlanmış AWF'yi 0,22 μm'lik bir şırınga filtresinden süzün ve süzüntüyü buz üzerine yerleştirilmiş 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın. NOT: Tipik olarak, 12 tesis bu protokolü kullanarak sonunda yaklaşık 6 mL AWF verir. Filtrelenmiş LSW, AWF ve LSS hemen kullanılabilir veya daha fazla kullanıma kadar -80 °C'de saklanabilir.</li>
	<li>AWF izolasyonundan sonra her çoğaltma için kullanılan bitkilerin taze ağırlığını (FW) kaydedin. Daha sonra, her numunedeki RNA miktarını normalleştirmek için bu okumayı kullanın (Şekil 2).</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68406/68406fig2.jpg"> 
Şekil 2: Protokolün ve yaprak yüzeyi sürüntü yönteminin şematik çizimleri. (A) Arabidopsis rozetleri kullanılarak yaprak yüzeyi yıkama ve apoplastik yıkama sıvısının izolasyonu için kademeli protokolün şematik gösterimi. (B) Yaprak yüzeyi RNA'sını izole etmek için yaprak yüzeyi swab (LSS) yönteminin şematik gösterimi. Borniego ve ark., 2025 Şekil S1 ve Şekil S4'ten uyarlanan şekiller6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68406/68406fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
5. RNA'nın çökelmesi
<ol>
	<li>Gerekli hacimde AWF, LSW veya LSS'yi 0.1 hacim 3 M sodyum asetat (pH 5.2) ve 1.0 hacim soğuk izopropanol ile 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde karıştırarak RNA'yı çökeltin.</li>
	<li>20 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyona glikojen (20 mg / mL stok) ekleyin. NOT: RNA'yı çökeltmek için kullanılan santrifüj tüplerinin 13.000 × g gibi yüksek bir hızda santrifüjlenebildiğinden emin olun. Bu aşamada tüplerin kırılması, RNA örneklerinin kaybına neden olabilir.</li>
	<li>Karışımı -20 °C'de en az 1 saat veya gece boyunca inkübe edin.</li>
	<li>Tüpleri 13.000 × g'da 4 ° C'de 30 dakika santrifüjleyin (JA-25.50 rotor).</li>
	<li>Peleti buz gibi p EtOH ile iki kez yıkayın ve en fazla 10 dakika kurumaya bırakın.</li>
	<li>Peletleri 100 μL ultra saf DNase/RNaz içermeyen su veya VIB içinde yeniden süspanse edin ve RNA'yı 1.5 mL santrifüj tüplerine aktarın. NOT: Bu adımdan sonra, çökelmiş RNA -80 °C'de 2 haftaya kadar saklanabilir.</li>
</ol>
6. TRIzol tabanlı RNA izolasyonu
<ol>
	<li>Her tüpe 1 mL TRIzol Reaktifi ekleyin ve bir döndürücü üzerinde çalkalayarak karıştırın. DİKKAT: TRIzol'u kullanmak için çeker ocakta kullanın, eldiven ve göz koruması kullanın.</li>
	<li>Tüpleri oda sıcaklığında (RT) 10 dakika boyunca bir masa üstü döndürücüye yerleştirin.</li>
	<li>Her tüpe 200 μL kloroform ekleyin, ardından kısa ama güçlü bir girdap adımı izleyin. DİKKAT: Kloroformu işlemek için çeker ocakta kullanın, eldiven ve göz koruması kullanın.</li>
	<li>Tüplerin RT'de yaklaşık 3 dakika durmasına izin verin ve ardından 13.000 × g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Sulu fazı etiketli 1.5 mL santrifüj tüplerine aktarın ve 10 μg RNaz içermeyen glikojen ve bir hacim soğuk izopropanol ekleyin. DİKKAT: Üretilen biyolojik olarak tehlikeli atıklar (fenol atıkları gibi) için, organik çözücüleri kurumsal yönergelere göre belirlenmiş atık kaplarında toplayın.</li>
	<li>Tüpleri -20 ° C'de en fazla 1 saat inkübe edin. NOT: Bu adımda RNA'yı 1 saatten fazla çökeltmek, RNA izolasyonunun verimliliğini azaltır ve çok düşük bir RNA konsantrasyonuna yol açar.</li>
	<li>RNA'yı peletlemek için tüpleri 13.000 × g'da 4 °C'de 20 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>RNA peletlerini buz gibi p EtOH kullanarak iki kez yıkayın ve 10-20 μL ultra saf DNaz/RNaz içermeyen suda yeniden süspanse etmeden önce kurumaya bırakın.</li>
	<li>Yeniden süspanse edilmiş RNA'yı kısa veya uzun süreli depolama için sırasıyla -20 °C veya -80 °C'de saklayın.</li>
</ol>
7. Fenol veya guanidin kontaminasyonunun giderilmesi
<ol>
	<li>RNA örneklerinden fenol veya guanidin kontaminasyonunu gidermek için,% 96 EtOH ve amonyum asetat ile bir veya iki seri çökeltme gerçekleştirin.</li>
	<li> </li><li></li><li></ol><ol><li><li><li><li><li></li><li></li><li></li></ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68406/68406fig3.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68406/68406fig3large.jpg" target="_blank"></a><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68406/68406fig4.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68406/68406fig4large.jpg" target="_blank"></a><ol><li><li> </li><li><ol><li></li><li><li></ol></li><li> </li><li> </li></ol><img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68406/68406fig5.jpg"> <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68406/68406fig5large.jpg" target="_blank"></a>

<ol><li>Vorholt, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+life+in+the+phyllosphere%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microbial life in the phyllosphere.</a> Nat Rev Microbiol. 10 (12), 828-840 (2012).</li>
<li>Ritpitakphong, U., Falquet, L., Vimoltust, A., Berger, A., M'etraux, J., L'Haridon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microbiome+of+the+leaf+surface+of+Arabidopsis+protects+against+a+fungal+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">The microbiome of the leaf surface of Arabidopsis protects against a fungal pathogen.</a> New Phytol. 210 (3), 1033-1043 (2016).</li>
<li>Chaudhry, V., Runge, P., Sengupta, P., Doehlemann, G., Parker, J. E., Kemen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shaping+the+leaf+microbiota%3A+plant-microbe-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Shaping the leaf microbiota: plant-microbe-microbe interactions.</a> J Exp Bot. 72 (1), 36-56 (2021).</li>
<li>Vacher, C., Hampe, A., Port'e, A. J., Sauer, U., Compant, S., Morris, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phyllosphere%3A+microbial+jungle+at+the+plant-climate+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Ecol+Evol+Syst%22%5BJournal%5D)">The phyllosphere: microbial jungle at the plant-climate interface.</a> Ann Rev Ecol Evol Syst. 47, 1-24 (2016).</li>
<li>Mahmoudi, M., Almario, J., Lutap, K., Nieselt, K., Kemen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+communities+living+inside+plant+leaves+or+on+the+leaf+surface+are+differently+shaped+by+environmental+cues%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Commun%22%5BJournal%5D)">Microbial communities living inside plant leaves or on the leaf surface are differently shaped by environmental cues.</a> ISME Commun. 4 (1), ycae103(2024).</li>
<li>Borniego, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+plant+RNAs+coat+Arabidopsis+leaves+and+are+distinct+from+apoplastic+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diverse plant RNAs coat Arabidopsis leaves and are distinct from apoplastic RNAs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 122 (1), e2409090121(2025).</li>
<li>Ren, B., Wang, X., Duan, J., Ma, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhizobial+tRNA-derived+small+RNAs+are+signal+molecules+regulating+plant+nodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Rhizobial tRNA-derived small RNAs are signal molecules regulating plant nodulation.</a> Science. 365 (6456), 919-922 (2019).</li>
<li>Chery, M., Drouard, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+tRNA+functions+beyond+their+major+role+in+translation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Bot%22%5BJournal%5D)">Plant tRNA functions beyond their major role in translation.</a> J Exp Bot. 74 (7), 2352-2363 (2022).</li>
<li>Panstruga, R., Spanu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+RNA+and+ribosomal+RNA+fragments-Emerging+players+in+plant-microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytol%22%5BJournal%5D)">Transfer RNA and ribosomal RNA fragments-Emerging players in plant-microbe interactions.</a> New Phytol. 241 (2), 567-577 (2024).</li>
<li>Baldrich, P., Rutter, B. D., Karimi, H. Z., Podicheti, R., Meyers, B. C., Innes, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+extracellular+vesicles+contain+diverse+small+RNA+species+and+are+enriched+in+10-+to+17-nucleotide+%26%2334%3BTiny%26%2334%3B+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plant extracellular vesicles contain diverse small RNA species and are enriched in 10- to 17-nucleotide &#34;Tiny&#34; RNAs.</a> Plant Cell. 31 (2), 315-324 (2019).</li>
<li>Rutter, B. D., Rutter, K. L., Innes, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+quantification+of+plant+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation and quantification of plant extracellular vesicles.</a> Bio Protoc. 7 (17), e2533(2017).</li>
<li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OsHSD1%2C+a+hydroxysteroid+dehydrogenase%2C+is+involved+in+cuticle+formation+and+lipid+homeostasis+in+rice%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">OsHSD1, a hydroxysteroid dehydrogenase, is involved in cuticle formation and lipid homeostasis in rice.</a> Plant Sci. 249, 35-45 (2016).</li>
<li>Zhou, L., Ni, E., Yang, J., Zhou, H., Liang, H., Li, J., Jiang, D., Wang, Z., Liu, Z., Zhuang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rice+OsGL1-6+is+involved+in+leaf+cuticular+wax+accumulation+and+drought+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Rice OsGL1-6 is involved in leaf cuticular wax accumulation and drought resistance.</a> PLoS One. 8 (5), e65139(2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>14-30 nt ssRNA merdiven işaretleyici</td><td>Takara</td><td>3416</td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL mikrosantrifüj tüpleri</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>10 mL iğnesiz şırınga</td><td>BD</td><td>303347</td><td></td></tr><tr><td>15 mL şahin tüpleri</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>%15 Mini-PROTEAN TBE-Urea Jel, 10 kuyucuk/12 kuyucuk, 30 &mikro; L/20 &mikro; L</td><td>Biyo-Rad</td><td>4566053 / 4566055</td><td></td></tr><tr><td>36 hücreli tepsi ekleri</td><td>Gerçek Yaprak Pazarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>%40 akrilamid ve bis-akrilamid çözeltisi, 37,5:1</td><td>Biyo-Rad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>4 inçlik yuvarlak kaplar</td><td>Gerçek Yaprak Pazarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL şahin tüpleri</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>50 mL iğnesiz şırınga</td><td>BD</td><td>309653</td><td></td></tr><tr><td>96 Kuyucuklu Plaka Siyah Alt</td><td>Grenier</td><td>655090</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 0.22 &mu; m şırınga filtresi</td><td>Polat</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 0.45 &mu; m şırınga filtresi</td><td>Polat</td><td>4454</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum persülfat (APS)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Kloroform (RNaz içermez)</td><td>Macron İnce Kimyasallar</td><td>MK444110</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf plastik kubbeler</td><td>Hummert Uluslararası</td><td>11 3348</td><td>Bitkileri örtmek ve nemi korumak için herhangi bir plastik kubbe kullanılabilir</td></tr><tr><td>Pamuk uçlu çubuk tıbbi sınıf</td><td>Ülin</td><td>S-21102</td><td></td></tr><tr><td>Etanol (Rnaz içermez)</td><td>Decon Laboratuvarları, Inc.</td><td>2716GEA</td><td></td></tr><tr><td>French Press kahve makinesi, 24 fl oz</td><td>Kar Zirvesi</td><td>CS-111 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Deliksiz yetiştirme tepsisi 10 x 20</td><td>Gerçek Yaprak Pazarı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buz kovası&nbsp;</td><td>Schuett-Biyoteknoloji, Sünger</td><td>3-680 052</td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td>Termo Bilimsel</td><td>149320050</td><td></td></tr><tr><td>JA-14 sabit açılı rotor</td><td>Beckman Coulter; modeli: JA-14</td><td>339247</td><td></td></tr><tr><td>Kimmendil</td><td>KCWW, Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Düşük menzilli ssRNA lader</td><td>NEB</td><td>N0364S</td><td></td></tr><tr><td>MES hidrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8250 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>&nbsp; Sinerji H1</td><td></td></tr><tr><td>Mucize-Gro</td><td>Mucize-Gro</td><td>24-8-16</td><td>Çok amaçlı bir bitki besinidir. Bitkileri yetiştirmek için kullanılan toprak kaynağına bağlı olarak uygulama ayarlanabilir.</td></tr><tr><td>Nalgene santifuge şişesi 250 mL (kapaksız)</td><td>Nalgen</td><td>3120</td><td></td></tr><tr><td>Kağıt havlular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ParaFilm&nbsp; M Laboratuvar Filmi</td><td>Parafilm</td><td>S-25929</td><td></td></tr><tr><td>Plastik beher (500 mL)</td><td>Ülin</td><td>S-21658</td><td></td></tr><tr><td>RNaz içermeyen glikojen (20 mg/mL)</td><td>Termo Bilimsel</td><td>R0561 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>RootShield Plus WP Biyolojik Mantar İlacı</td><td>Biyo İşler</td><td>68539-9</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Bitki teknolojisi laboratuvarları</td><td>S7777 Serisi</td><td>Herhangi bir marka Silwet L-77 kullanılabilir. Ancak Silwet zamanla etkinliğini kaybeder. Yılda bir kez değiştirilmesi idealdir.</td></tr><tr><td>Sodyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Yumuşak naylon saç boya fırçası</td><td>ABD. Sanat Kaynağı</td><td>6 numara</td><td></td></tr><tr><td>Sprey şişesi</td><td>Ülin</td><td>S-7272</td><td>Herhangi bir sprey şişesi kullanılabilir ancak sprey ayarları duşta olmalıdır.</td></tr><tr><td>Sungro Profesyonel Yetiştirme Karışımı</td><td>Sungro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sungro Çoğaltma Karışımı</td><td>Sungro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SYBR Altın Nükleik Asit Jel Boyası (DMSO'da 10.000x konsantre)</td><td>Termo Bilimsel</td><td>S11494</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Termo Bilimsel</td><td>17919</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol reaktifi</td><td>Davetli</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>Ultra saf Dnase/Rnase içermeyen su</td><td>Davetli</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Üre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378 Serisi</td><td></td></tr><tr><td>Vakum odası, 0.20 Cu. Ft.</td><td>SP Scienceware - Bel-Art Ürünleri - H-B Enstrüman</td><td>F42031-0000</td><td></td></tr><tr><td>Vakum pompası, 3,5 CFM</td><td>İdeal Vakum Ürünleri</td><td>P101532</td><td></td></tr><tr><td>Tartı ölçeği</td><td>Escali</td><td>WBB480535</td><td>Bu sadece bir örnek. Herhangi bir tartı kullanılabilir.</td></tr></tbody></table>

arabidopsis rozetleri kullanılarak yaprak yüzeyi ve apoplastik rna'nın izolasyonu ve analizi için aşamalı bir kılavuz

A Stepwise Guide to the Isolation and Analysis of Leaf Surface and Apoplastic RNA Using Arabidopsis Rosettes

Arabidopsis rozetleri kullanılarak yaprak yüzeyi ve apoplastik RNA'nın izolasyonu ve analizi için aşamalı bir kılavuz

The surface of plant leaves and intercellular space within leaves (the apoplast) serve as key interfaces for molecular exchange between plants and their ...

a-stepwise-guide-to-isolation-analysis-leaf-surface-apoplastic-rna

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu video 14 günlük fide Arabidopsis dokuları bozulmadan protoplast izole etmek için bir prosedür gösterir. Izole protoplast en az 96h bozulmadan kalır ve bir aylık olgun bitkilerin yerine fide izole olduğunu göz önüne alındığında, bu yordamı sağlam protoplast gerektiren testleri hızlandırır.

14 gün eski Fideler Dokular protoplast izolasyonu Arabidopsis thaliana</em

Hücre Özgül Analizi<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Floresans Aktif Hücre Ayırma kullanma Leaves

Biz gelen geliştirmenin erken aşamalarında embriyo izole için etkili ve basit bir yöntem...

Erken evre Embriyolar verimli ve hızlı İzolasyon<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Tohumlar

Bu protokol, bağlı ribozom sayısına dayanarak bitki dokularından transkriptleri çıkarmak ve fraksiyonlamak için kolay bir yöntemi açıklar. Translasyon aktivitesinin küresel bir tahminine ve belirli mRNA'ların translasyon durumunun belirlenmesine izin verir.

Bitki Polizom Profiling için bir Kolay Yöntem

Burada, Arabidopsis thaliana yaprak mezofil protoplastlarına uygulanan bir etkileşimli yakalama protokolünü sunuyoruz. Bu yöntem kritik olarak in vivo UV çapraz bağlanmaya dayanır ve fizyolojik bir ortamdan bitki mRNA'ya bağlanan proteinlerin izole edilmesine ve tanımlanmasına izin verir.

Bitki Protoplastlarından mRNA İnteraktom Yakalama

Burada, bitki büyüme davranış ve özellikle fenotipleri tekrarlanabilir bir şekilde eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Değişken ve aynı zaman istikrarlı ışık koşulları sağlamak için nasıl gösterir. Uygun analizleri yeterli örnek numaraları ve geçerli istatistiksel değerlendirme bağlıdır.

Farklı ışık nitelikleri Arabidopsis thaliana büyüme davranış analizi

Burada, bitki patojenlerinde RNA susturucularını hızlı bir şekilde taramak için yaygın olarak kullanılabilecek değiştirilmiş bir tarama yöntemi salıyoruz.

Bitki Patojenlerinin Gizli Efektörlerinden RNA Susturucu Baskılayıcıların Taranması ve Tanımlanması

Ribozom yakınlık arınması (TRAP) çevirisi, organ ve dokuların en az işlenmesi yle gelişim programlarını inceleme olanağı sunar. Protokol, yeşil floresan protein (GFP) etiketli ribozomal alt ünite ile hedeflenen hücrelerden yüksek kaliteli RNA verir. QRT-PCR veya RNA-seq gibi alt akış analiz araçları doku ve hücre tipine özgü ifade profillerini ortaya çıkarır.

Bir Hücre Tipine Özel Ölçekte Arabidopsis thaliana Kök Gelişimini Araştırmak Için Ribozom Affinity Arınma (TRAP) Çevirisi

Yüksek verimli scRNA-seq yöntemlerinin fizibilitesi ve etkinliği, bitki araştırmalarında tek hücreli bir çağın habercisidir. Burada, spesifik Arabidopsis thaliana kök hücre tiplerinin izole edilmesi ve ardından transkriptom kütüphanesi yapımı ve analizi için sağlam ve eksiksiz bir prosedür sunulmaktadır.

Bitki Hücre Tiplerinin İzolasyonu ve Transkriptom Analizi

Bu protokol, Arabidopsis thaliana yapraklarından hücre dışı veziküllerin (EV) izole edilmesi için optimize edilmiş bir yöntemi tanımlar; bu yöntem aşağı akış moleküler ve fonksiyonel analizleri destekler.

Arabidopsis yapraklarından bitki ekstrasellüleri veziküllerinin optimize edilmiş apoplastik yıkama toplama yöntemiyle izolyasyonu ve arındırılması

Öğrenin, Arabidopsis rozetlerinden yaprak yüzeyi ve apoplastik RNA izolasyonu yöntemini. Yüksek çözünürlüklü jel elektroforezi ve Illumina analizi ile biyotik strese yanıtı inceleyin.

Arabidopsis rozetleri kullanılarak yaprak yüzeyi ve apoplastik RNA'nın izolasyonu ve analizi için aşamalı bir kılavuz

Daha fazla video keşfet