Arabidopsis rozetleri kullanılarak yaprak yüzeyi ve apoplastik RNA'nın izolasyonu ve analizi için aşamalı bir kılavuz

Bitkilerin mikrobiyomlarını nasıl düzenlediğini ve bitkiler tarafından salgılanan RNA'ların, bitkileri kolonize eden hem prokaryotik hem de ökaryotik mikroplarda gen ekspresyonunu düzenleyip düzenlemediğini anlamaya çalışıyoruz. Yaprak yüzeyinde bulunan RNA'ları ve biyotik strese yanıt olarak nasıl değiştiklerini değerlendirmek için yüksek çözünürlüklü kabuk elektroforezi ve Illumina tabanlı analizin bir kombinasyonunu kullanıyoruz. Son çalışmalar, hücre dışı RNA'ların mantar ve bakteri patojenleri tarafından alındığını öne sürse de, RNA alımının altında yatan mekanizmalar ve bu alımın fonksiyonel sonuçları büyük ölçüde keşfedilmemiş durumda.

Başlamak için, her kopya için altı ila yedi haftalık arabidopsis bitkileri alın. Yaprak yüzeyi yıkamasının izolasyonuna başlamadan önce steril VIB'ye siluet L-77 ekleyin. Daha sonra bir ölçüm silindiri kullanarak hazırlanan VIB çözeltisinin 100 mililitresini 500 mililitrelik bir sprey şişesine aktarın.

İnce bir makas kullanarak arabidopsis rozetlerini köklerinden dikkatlice ayırın. Bundan sonra, yapraklardaki fazla kiri temizlemek için yumuşak bir fırça kullanın. Ayrılan rozetleri, abaksiyal yüzeyi yukarı bakacak şekilde düz bir tepsiye yerleştirin.

Ardından, VIB ve ıslatıcı madde ile doldurulmuş sprey şişesinin beş pompasını kullanarak abaksiyal yüzeye püskürtün. Rozetleri dikkatlice ters çevirin ve adaksiyal yüzeye püskürtün. Ucu şişenin dibinin üzerine asmak için boynun etrafına para film ile sararak altta delikli modifiye şırıngalar hazırlayın.

Yaprak yüzey yıkamasını geri kazanmak için, püskürtülen rozetleri 250 mililitrelik santrifüj şişelerinin içine yerleştirilmiş iğnesiz 60 mililitrelik modifiye şırıngalara nazikçe yerleştirin ve şırıngaya iki sert tampon pompası püskürtün. Daha sonra yüklenen şişeleri 100 G'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin. Şimdi geri kazanılan yaprak yüzeyini 0,22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirin ve süzüntüyü buz üzerinde tutulan 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde toplayın.

Yaprak yüzeyi sürüntü yöntemi için, ayrılan rozetlere önceki adımda anlatıldığı gibi VIB ve ıslatıcı madde solüsyonu püskürtün. Yaprak yüzeyindeki swabı kurtarmak için, rozetlerin hem adaksiyal hem de abaksiyal yüzeylerini temizlemek için steril pamuklu çubuklar kullanın. Ardından, sıvıyı çıkarmak için ıslatılmış uçları 15 mililitrelik bir santrifüj tüpünün iç duvarına bastırın.

Ekstrakte edilen yaprak yüzeyi sürüntü örneğini 0.22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden geçirerek buz üzerine yerleştirilmiş iki mililitrelik bir tüpe süzün. Daha önce yaprak yüzeyi yıkama veya çubuk izolasyonu için kullanılan aynı bitki setini temiz bir behere yerleştirin ve damıtılmış suyla iki kez hafifçe durulayın. Rozetleri VIB ile vakumla sızdırmak için, durulanmış rozetleri 300 ila 500 mililitre VIB içeren bir French press kahve makinesine dikkatlice yerleştirin.

Kapağı sabitleyin ve rozetler tamamen suya batana kadar pistonu yavaşça indirin. French press'i bir vakum odasına yerleştirin ve bitkiler iyice sızana kadar bir vakum pompası kullanarak 20 saniye vakum uygulayın. Vakumu serbest bıraktıktan sonra French press'i hazneden çıkarın ve kapağı çıkarın.

VIB'yi 500 mililitrelik plastik bir behere dökün ve rozetleri çıkarın. Ardından rozetleri hafifçe sallayın ve fazla tamponu çıkarmak için yaprakları bir kağıt havlu üzerinde fırçalayın. Şimdi kurutma kağıdı kullanarak, kalan tamponu çıkarmak için yaprak yüzeylerini hafifçe kurulayın.

Aplastik yıkama sıvısını toplamak için, VIB sızmış rozetleri, daha önce yapıldığı gibi 250 mililitrelik santrifüj şişelerinin içine yerleştirilmiş 60 mililitrelik iğnesiz şırıngalara yerleştirin. Şişeleri 600 G'de 30 dakika boyunca dört santigrat derecede yavaş hızlanma ile santrifüjleyin. Daha sonra havuzlanmış aplastik yıkama sıvısını buz üzerine yerleştirilmiş 15 mililitrelik bir tüp içinde 0,22 mikrometrelik bir şırınga filtresinden süzün.

Bir akrilamid ve bis çözeltisi kullanarak trisborik asit EDTA tamponunda %10 veya %15 poliakrilamid ve yedi molar üre içeren bir mini jel hazırlayın veya satın alın. Daha sonra RNA örneklerini iki kez denatüre edici yükleme tamponu ile karıştırın. Karışımı 65 santigrat derecede beş dakika ısıtın ve hemen buzun üzerine koyun.

Şimdi RNA örneklerini oda sıcaklığında yaklaşık bir saat 15 dakika boyunca 220 volt uygulayarak 0,5 kat TBE çalışma tamponunda çözün. Daha sonra jeli siber altın nükleik asit jel boyası ile 0,5 kez TBE'de 10 dakika boyunca boyayın. Jeli damıtılmış suyla iki kez durulayın ve bir görüntüleme sistemi kullanarak görüntüleyin.

Çözülen RNA bantlarını ölçmek için, analiz ve jel analizi menüsü altındaki Görüntü J belgelerindeki jel analiz yöntemini kullanın. Hücre lizatı RNA'sını RNaz ve DNaz içermeyen suda seyrelterek iki teknik kopya için RNA standartlarını hazırlayın. 1,5 kat siber altın nükleik asit jel boyası hazırlamak için, pH sekizde 500 milimolar tris HCL tamponunda çözün.

Mikroplaka kurulumu için her kuyucuğa 99 mikrolitre damıtılmış su ekleyin. Ardından, hem RNA örnekleri hem de standartlar için aynı hacmi kullanarak her kuyucuğa bir mikrolitre RNA ekleyin. Son olarak, her kuyucuğa 50 mikrolitre siber altın çözeltisi ekleyin.

Mikro plaka okuyucu parametrelerini ayarlamak için, üç saniye boyunca doğrusal veya yörüngesel sallamayı seçin. Mikro plaka okuyucuyu 496 nanometre uyarma dalga boyu ve 540 nanometre emisyon dalga boyu ile floresan uç nokta moduna ayarlayın. RNA standartlarındaki floresan yoğunluk değerlerini kullanarak bir kalibrasyon çizgisi oluşturun.

Denatüre edici RNA jel analizi, hem yaprak yüzeyi yıkama hem de aplastik yıkama sıvısı örneklerinin, hem uzun hem de küçük RNA türleri dahil olmak üzere çok çeşitli RNA boyutları içerdiğini ortaya çıkardı. Aplastik yıkama sıvısından ve yaprak yüzeyi yıkamasından izole edilen toplam RNA miktarları, bitkinin taze ağırlığına göre normalleştirildiğinde benzerdi. Yaprak yüzeyi yıkama, aplastik yıkama ve hücre lizatının RNA profilleri belirgin şekilde farklılık gösterir, bu da minimum hücre içi RNA kontaminasyonunu doğrular ve aplastik RNA'nın vezikül izolasyon tamponuna %0.001 siluet L-77'nin yaygın düşük moleküler ağırlıklı bantlar ilavesiyle yüksek oranda işlendiğini gösterir, ıslatıcı madde içermeyen tampona kıyasla yaprak yüzeylerinden RNA verimini neredeyse iki katına çıkarır.

Ancak bu konsantrasyonun %0.01'e çıkarılması, RNA geri kazanımını daha da artırmadı. Aynı yaprakların ikinci bir yıkaması, ilk yıkamada elde edilen RNA'nın yaklaşık %63'ünü geri kazandı, bu da yaprak yüzeyinde devam eden RNA salgılanmasını gösterir. Floresan bazlı mikrotitre plaka deneyleri kullanılarak RNA ölçümü, hem siber altın hem de RIBO 488 tespit yöntemleri için RNA konsantrasyonu ile yüksek doğrusallık gösterdi.

tRNA ve tRNA'dan türetilen fragmanların veya TDR'lerin, muhtemelen bozunmaya karşı dirençleri nedeniyle hücre dışı RNA'da özellikle bol miktarda bulunduğunu gösterdik. Bu nedenle, bu TDR'lerin muhtemelen bakterilerde gen ekspresyonunu düzenlediğine inanıyoruz. Yaprak yüzeyi RNA'sının hücresel kaynaklarını ve bu yaprak yüzeyi RNazının planlanan mikrop etkileşimleri bağlamında oynayabileceği biyolojik rolleri belirlemek istiyoruz.